王繼升 鮑丙豪 鄧 省 馮雋龍 李海松

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院男科，北京 100700

[關(guān)鍵字]菟絲子；枸杞子；男性不育癥；增殖；凋亡

男性不育癥是指夫婦有規(guī)律性生活1 年以上，未采用避孕措施，由于男方因素造成女方無(wú)法自然受孕[1]。研究表明，有10%～15%的夫婦面臨不孕不育的困擾[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎精虧虛是導(dǎo)致男性生精功能障礙的重要病因[3-4]，而菟絲子-枸杞子藥對(duì)是臨床中常用的補(bǔ)腎填精藥物組合，在臨床上被廣泛用于少弱精子癥的治療[5-6]。

精原細(xì)胞是精子生成的基礎(chǔ)，本課題組既往研究表明，菟絲子-枸杞子可對(duì)精原細(xì)胞有修復(fù)作用[7-9]。本研究擬觀察菟絲子-枸杞子對(duì)精原細(xì)胞的增殖、周期及超微結(jié)構(gòu)的治療作用，為補(bǔ)腎填精法治療男性不育癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

動(dòng)物：北京維通利華有限公司提供6 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠20 只，體重（200±20）g，主要用于含藥血清制備，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物合格證號(hào)：1100111911000582。實(shí)驗(yàn)實(shí)施、動(dòng)物喂養(yǎng)均在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心進(jìn)行，飼養(yǎng)條件依照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)條件。

細(xì)胞：精原細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽公司（貨號(hào)：CL-0600），當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%～80%時(shí)，按1∶5 比例傳代培養(yǎng)，48 h 更換完全培養(yǎng)基。本研究通過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（NO：19-27）。

1.2 主要試劑與儀器

雷公藤多苷（批號(hào)：130801，每片10 mg），左卡尼汀口服液（批號(hào)：130801），菟絲子-枸杞子免煎顆粒劑各15 g，均購(gòu)自北京康仁堂股份有限公司。細(xì)胞凋亡（T2190）、細(xì)胞周期（CA1510）、線粒體膜電位（M8650）試劑盒均購(gòu)自Solarbio 公司。

透射電子顯微鏡[日本Hitachi HT7700（80KV）]、全自動(dòng)脫水機(jī)（沈陽(yáng)譽(yù)德有限公司SYD-T2070）、石蠟包埋機(jī)（沈陽(yáng)譽(yù)德有限公司SYD-B-F）、石蠟切片機(jī)（沈陽(yáng)譽(yù)德有限公司SYD-S3020）、離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司Centrifuge 5415D）、超凈工作臺(tái)（中國(guó)東聯(lián)FLC-3 型）。

1.3 含藥血清制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將20 只大鼠分為空白組、雷公藤多苷組、左卡尼汀組、藥對(duì)組，每組5 只。分別予以去離子水[10 ml/（kg·d）]、雷公藤多苷[40 mg/（kg·d）]，左卡尼汀口服液[0.2 g/（kg·d）]、菟絲子-枸杞子藥對(duì)[0.45 g/（kg·d）]灌胃，每天上午10 點(diǎn)灌胃，連續(xù)7 d，末次灌藥的2 h 后麻醉，腹主動(dòng)脈采血，取血清備用。

1.4 分組及干預(yù)

將細(xì)胞隨即分為四組：空白組、模型組、左卡尼汀組、藥對(duì)組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到6 孔板中，每孔2 ml 完全培養(yǎng)基，接種密度為每孔2×105個(gè)細(xì)胞，24 h后更換相應(yīng)培養(yǎng)基干預(yù)，具體如下：空白組予完全培養(yǎng)基，模型組、左卡尼汀組、藥對(duì)組首先用10%雷公藤多苷灌胃大鼠含藥血清制備生精功能障礙模型[10-11]，隨后左卡尼汀組、藥對(duì)組再分別予以左卡尼汀、菟絲子-枸杞子10%含藥血清干預(yù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后收集相應(yīng)細(xì)胞用于檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

棄去原培養(yǎng)液，冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，離心機(jī)離心（1 000 g，4℃，10 min），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。加入500 μl Binding Buffer，1 000 g 離心5 min 后棄上清，再加入100 μl Binding Buffer 混勻后，分別加入5 μl AnnexinV-FITC 與10μlPI，室溫25℃避光反應(yīng)25min，最后加入Binding Buffer，輕輕混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

棄去原培養(yǎng)液，冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，離心機(jī)離心（1 000 g，4℃，10 min）。加入1 ml PBS 重懸細(xì)胞，1 000 g 離心3 min，棄上清。加入500 μl PI/RNase 染色液，25℃避光孵育15 min 后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 線粒體膜電位檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞待其完全貼壁后吸去上清液，PBS 洗滌細(xì)胞，在6 孔板中加入1 ml 細(xì)胞培養(yǎng)基及1 ml JC-1 染色工作液，充分混勻后于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，棄去上清，每孔加入1 ml JC-1 染色緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，最后棄上清，加入PBS 重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

1.8 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

含藥血清干預(yù)各組細(xì)胞48 h 后，棄培養(yǎng)基，先用PBS 沖洗2 遍，胰酶消化后加PBS 重懸細(xì)胞后移至EP 管，1 000 g 離心5 min 后，棄上清，收集細(xì)胞團(tuán)塊，加入2.5%戊二醛，4℃冰箱過夜固定，隨后脫水、切片，透射電鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較

與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，藥對(duì)組細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，）

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，）

注 與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.2 各組細(xì)胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比較

與空白組比較，模型組細(xì)胞的G0/G1和G2/M 期百分率顯著降低、S 期百分率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與模型組比較，藥對(duì)組細(xì)胞的G0/G1和G2/M 期百分率顯著升高、S 期百分率顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2、圖2。

表2 各組細(xì)胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比較（%）

表2 各組細(xì)胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比較（%）

注 與空白組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期

2.3 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較

與空白組比較，模型組細(xì)胞中線粒體膜電位顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，藥對(duì)組細(xì)胞中線粒體膜電位顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表3、圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位

表3 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較（%，）

表3 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較（%，）

注 與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01

2.4 四組精原細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷情況

空白組細(xì)胞的各細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，模型組細(xì)胞膜大面積破裂，細(xì)胞基質(zhì)大面積密度減低，空泡變。細(xì)胞內(nèi)眾多細(xì)胞器損傷，如細(xì)胞核形狀變形嚴(yán)重，局部凹陷；線粒體重度腫脹變形，嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張；高爾基體肥大。左卡尼汀組和藥對(duì)組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞基質(zhì)大面積密度正常。細(xì)胞核形狀飽滿；線粒體結(jié)構(gòu)完整；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體結(jié)構(gòu)正常。見圖4。

圖4 電鏡觀察細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)

3 討論

菟絲子-枸杞子藥對(duì)是補(bǔ)腎填精常用中藥組合，近年來(lái)有多項(xiàng)研究證明，菟絲子-枸杞子藥對(duì)可從多方面改善精子質(zhì)量[12-14]。細(xì)胞周期是親代細(xì)胞分裂結(jié)束到子代細(xì)胞分裂結(jié)束所需的時(shí)間，其對(duì)于生精細(xì)胞的正常與否起到關(guān)鍵作用[15-16]。細(xì)胞周期由4 個(gè)階段組成，G0/G1期細(xì)胞處于DNA 復(fù)制過程之前；S 期細(xì)胞處于正在進(jìn)行DNA 的復(fù)制，但是整個(gè)DNA 復(fù)制過程并沒有全部完成；G2/M 期細(xì)胞已經(jīng)完成了DNA 復(fù)制過程[17]。本研究中，課題組發(fā)現(xiàn)菟絲子-枸杞子含藥血清干預(yù)后精原細(xì)胞G2/M 期比例明顯升高且細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示菟絲子-枸杞子藥對(duì)含藥血清可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的變化進(jìn)而改善雷公藤多苷損傷的細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，菟絲子-枸杞子藥對(duì)含藥血清可以改善線粒體膜電位水平同時(shí)修復(fù)線粒體及其他細(xì)胞器損傷。線粒體功能正常對(duì)于調(diào)控細(xì)胞周期和增殖具有重要作用[18]。作為細(xì)胞內(nèi)生成腺苷三磷酸的主要場(chǎng)所，線粒體是促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。線粒體膜電位耗損可嚴(yán)重影響線粒體功能，引起細(xì)胞凋亡率增加，線粒體膜電位是反映線粒體功能的重要指標(biāo)[19-21]。在人類精子中，線粒體主要位于精子鞭毛中段，所產(chǎn)生的腺苷三磷酸為精子前向運(yùn)動(dòng)提供了必要的能量供應(yīng)[22-24]。精子線粒體膜電位與精子活力、存活率和受精能力呈正相關(guān)，線粒體膜電位的下降意味著精子活動(dòng)所必需的能量供應(yīng)合成障礙，引起精子活力下降及生精細(xì)胞凋亡增加[25-28]。

綜上，本研究從線粒體膜電位、細(xì)胞周期與凋亡等方面入手，利用雷公藤多苷誘導(dǎo)生精功能障礙模型。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子-枸杞子可以有效修復(fù)雷公藤多苷誘導(dǎo)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，抑制其凋亡，這可能與其調(diào)節(jié)精原細(xì)胞周期、改善細(xì)胞線粒體膜電位有關(guān)，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。