侯著法趙冰潔車 虹易文靜劉培佳劉松山

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液科,成都 610072)

彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常見(jiàn)和最具侵襲性的淋巴組織腫瘤之一,占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin Lymphoma,NHL) 病 例 的30% ～ 40%[1]。DLBCL 具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)快、惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。 早期淋巴瘤的治愈率約為40%～60%,而晚期淋巴瘤的5 年生存率不到30%,盡管目前標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)治療方案可以提高DLBCL 患者的有效率,但30%～40%的患者對(duì)治療無(wú)效或治療后復(fù)發(fā),這表明標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒治療有其局限性[3-4]。 因此,有必要尋找新的治療藥物或治療策略,以有效地提高DLBCL 患者的生存率或延緩其復(fù)發(fā)。

目前,DLBCL 的治療臨床應(yīng)用最廣泛的為西藥,中藥是一個(gè)全新的選擇,研究報(bào)道中醫(yī)藥已廣泛應(yīng)用于癌癥的治療,天然產(chǎn)物/草藥可以為包括DLBCL 在內(nèi)的多種腫瘤的單一療法或聯(lián)合治療提供其他策略[5]。 對(duì)香豆酸(p-coumaric acid,p-CA)是白花蛇舌草的主要成分,白花蛇舌草作為一種被廣泛研究的抗腫瘤中草藥,已被證明可以抑制NHL細(xì)胞增殖[6]。 此外,研究報(bào)道對(duì)香豆酸組合物可抑制白血病細(xì)胞株Kasumi-1 的增殖,具有抗腫瘤作用[7]。 然而,對(duì)香豆酸對(duì)DLBCL 的作用尚不清楚。研究顯示葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)的誘導(dǎo)和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的激活在致癌性進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用,因此,可以利用癌細(xì)胞對(duì)這些UPR 信號(hào)通路的生存依賴性增加來(lái)進(jìn)行抗癌研究[8]。 基于此,本研究擬探討對(duì)香豆酸對(duì)DLBCL 的作用,并初步探討其作用機(jī)制,以期為DLBCL 的治療提供潛在方法。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY1 細(xì)胞(批號(hào):BFN60808875)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器

對(duì)香豆酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)購(gòu)自Sigma;CCK8 試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Annexin V/PI 凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司;GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 抗體及β-actin 抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司;Western blot 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。 低溫高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀集團(tuán);流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司;電泳儀購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Bio-Rad 全功能成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,置于37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,傳代1 次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按照5×103個(gè)/孔的細(xì)胞量將細(xì)胞接種于96 孔板中,置于37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分組加入不同濃度對(duì)香豆酸(0、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L),每個(gè)樣本設(shè)6 個(gè)平行孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 隨后,每孔加入10 μL CCK8 溶液,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h,通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的光密度值(OD)來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖情況。 抑制率(%)=[1-(OD 實(shí)驗(yàn)組-OD 空白組)/(OD 對(duì)照組-OD 空白組)]×100%,計(jì)算對(duì)香豆酸IC50進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Annexin V/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按照5×105個(gè)細(xì)胞/皿的密度接種細(xì)胞至60 mm 培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h 后設(shè)置分組為:(1)空白對(duì)照組、對(duì)香豆酸(1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組);(2)空白對(duì)照組、對(duì)香豆酸IC50、4-PBA 組(5 mmol/L)、IC50+4-PBA 組。 按組別分別加入對(duì)香豆酸或4-PBA。 采用Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡,將細(xì)胞用冰冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌后,用含有Annexin V 和PI 的結(jié)合緩沖液在室溫黑暗環(huán)境中孵育15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡并分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)

設(shè)置分組:(1)空白對(duì)照組、對(duì)香豆酸(1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組);(2)空白對(duì)照組、對(duì)香豆酸IC50、4-PBA 組(5 mmol/L)、IC50+4-PBA 組,按組別分別干預(yù)。 24 h 后收集細(xì)胞并用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解,BCA 試劑盒測(cè)量細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)濃度,經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳后,將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,用5%脫脂牛奶室溫孵育1 h 后,分別與GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α(1 ∶500)或β-actin(1 ∶1000)一抗在4℃下孵育過(guò)夜,再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下孵育2 h。 ECL 試劑盒檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶,使用Bio-Rad 全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-ProPlus 分析光密度,以β-actin 為內(nèi)參,對(duì)照組目標(biāo)蛋白質(zhì)相對(duì)含量為1,計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞增殖的影響

對(duì)香豆酸以劑量依賴性方式抑制OCI-LY1 細(xì)胞的增殖,對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞的IC50值為2.601 mmol/L(圖1)。

圖1 對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of p-coumaric acid on the proliferation of OCI-LY1 cells

2.2 對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組相比,對(duì)香豆酸1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01),且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2)。

圖2 對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞凋亡的影響Note. Compared with control group,**P<0.01.Figure 2 Effect of p-coumaric acid on apoptosis of OCI-LY1 cells

2.3 對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比,對(duì)香豆酸1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)(圖3)。

圖3 對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note. Compared with control group,**P<0.01.Figure 3 Effect of p-coumaric acid on the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in OCI-LY1 cells

2.4 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)對(duì)香豆酸作用OCI-LY1 細(xì)胞的影響

流式細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,IC50組、IC50+4-PBA 組細(xì)胞凋亡明顯升高,4-PBA組細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.05);與IC50組相比,4-PBA 組、IC50+4-PBA 組細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.01);與4-PBA 組相比,IC50+4-PBA 組細(xì)胞凋亡明顯升高(P<0.05)(圖4A、圖4C)。 CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,IC50組、IC50+4-PBA 組細(xì)胞抑制率明顯升高(P<0.01);與IC50組相比,4-PBA 組、IC50+4-PBA 組細(xì)胞抑制率明顯降低(P<0.01);與4-PBA 組相比,IC50+4-PBA 組細(xì)胞抑制率明顯升高(P<0.01)(圖4B)。 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,IC50組、4-PBA+IC50組細(xì)胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯升高,4-PBA 組細(xì)胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01);與IC50組相比,4-PBA 組、4-PBA+IC50組細(xì)胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01);與4-PBA 組相比,4-PBA+IC50組細(xì)胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)(圖4D)。

圖4 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)對(duì)香豆酸作用OCI-LY1 細(xì)胞的影響Note. Compared with control group,**P<0.01. Compared with IC50 group,##P<0.01. Compared with 4-PBA group,ΔΔP<0.01.Figure 4 Effects of endoplasmic reticulum stress inhibition on p-coumaric acid-acting OCI-LY1 cells

3 討論

DLBCL 患者預(yù)后較差,雖然應(yīng)用R-CHOP 治療方案可以進(jìn)一步提高化療效果,但近40%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)/難治性問(wèn)題[4]。 因此,迫切需要有效的新治療方法和/或新藥來(lái)改善治療結(jié)果。 對(duì)香豆酸作為白花蛇舌草的主要成分之一,對(duì)香豆酸可通過(guò)調(diào)節(jié)某些microRNA 的表達(dá)在SNU-16 胃癌細(xì)胞中發(fā)揮其抗癌作用[9]。 可通過(guò)激活PERK-eIF2α-ATF-4-CHOP 通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Grp78 上調(diào)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。 此外,對(duì)香豆酸可通過(guò)改善1,2-二甲基肼給藥大鼠結(jié)腸的解毒和凋亡過(guò)程來(lái)抑制息肉的形成[11]。 然而,對(duì)香豆酸在DLBCL 中的作用尚未得到深入研究。 由此,本研究以O(shè)CI-LY1 細(xì)胞為研究對(duì)象,探討了對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制。

研究已表明成功的抗癌治療涉及有效和特異的腫瘤細(xì)胞死亡[12]。 在本研究中,對(duì)香豆酸誘導(dǎo)了惡性O(shè)CI-LY1 細(xì)胞的凋亡,且呈現(xiàn)劑量依賴性方式降低其存活率。 表明對(duì)香豆酸對(duì)OCI-LY1 細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。 研究顯示腫瘤細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制決定細(xì)胞的命運(yùn),在包括淋巴瘤在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中參與細(xì)胞凋亡[13]。 在正常情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激結(jié)合的傳感器,即PERK、IRE1α 和ATF6 通過(guò)GRP78 的關(guān)聯(lián)而保持在非激活狀態(tài);在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,GRP78 從傳感器上解離,未折疊蛋白反應(yīng)被激活,游離的GRP78 作為伴侶幫助新合成的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)正確的折疊[14-15]。 此外,PERK 激活導(dǎo)致eIF2a 磷酸化,阻止大部分蛋白質(zhì)的翻譯,但持續(xù)的PERK 信號(hào)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CHOP,從而誘導(dǎo)DNA 損傷蛋白,下調(diào)生存期蛋白(Bcl2)[16]。 最后,ATF6 轉(zhuǎn)位到高爾基體,在那里它的胞漿片段(ATF6f)控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的降解基因[17]。 在本研究中,我們研究了GRP78 及其下游靶點(diǎn)在對(duì)香豆酸干預(yù)的OCI-LY1 細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示對(duì)香豆酸干預(yù)的OCI-LY1 細(xì) 胞 中GRP78、ATF6、 CHOP、 p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯升高,說(shuō)明對(duì)香豆酸通過(guò)誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)抑制適應(yīng)性反應(yīng)。 本研究得到了先前研究的證實(shí),這些研究報(bào)道了某些化合物,如蝴蝶苷B(Oroxin B)、EHMT2 抑制劑Bix-01294 等,能夠誘導(dǎo)B 淋巴瘤細(xì)胞抑瘤性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18-19]。 為了進(jìn)一步明確對(duì)香豆酸是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響OCI-LY1 細(xì)胞凋亡,本研究采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA 作用細(xì)胞,結(jié)果顯示,與對(duì)香豆酸 IC50組相比,4-PBA 組、4-PBA+IC50組細(xì)胞凋亡及GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯降低,但相比4-PBA 組,4-PBA+IC50組細(xì)胞凋亡及GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達(dá)明顯升高。 提示對(duì)香豆酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步誘導(dǎo)了下游的凋亡信號(hào)。

綜上所述,本研究表明對(duì)香豆酸可能激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào),進(jìn)而誘導(dǎo)OCI-LY1 細(xì)胞凋亡,是一種有效的治療DLBCL 的潛在預(yù)防藥物,對(duì)提高DLBCL 的治療效果具有重要的藥用價(jià)值。