張傳印，蔣蔚，劉鵬選，王權(quán) ，葉方鈺，謝雨芮，韓先干，陳偉*

（1塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，由食品污染引起的食物中毒高達(dá)85%［1］。阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii，CS）是常見的一種食源性致病菌，該菌為革蘭陰性菌，周生鞭毛、無芽胞，自身免疫力低下的人群如嬰幼兒、老人及受過免疫損傷的成年人易感［2］。CS感染人體后能引起嚴(yán)重的腦膜炎、敗血癥、壞死性結(jié)腸炎等［3］，甚至?xí)纬赡[瘤，影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育［4］。該菌主要分布于嬰幼兒食品及沖調(diào)食品中［5］，但王小龍等［6］的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)從谷物、藕粉、芝麻糊中能檢測出CS，在面粉、香料、掛面、蔬菜、燕麥中也能檢測出CS［7］。在某些CS感染患者的尿液、腦脊液、胃腸道［8］均能檢出此菌，這表明此菌帶來的危害嚴(yán)重，亟需加大防控力度。

CS為克羅諾桿菌屬，該屬含7個種，其余6個種分別為莫氏克羅諾桿菌、廣泛克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌、康迪蒙提克羅諾桿菌［9］，其中丙二酸克羅諾桿菌和阪崎克羅諾桿菌是臨床株［10］，這意味著致病的克羅諾菌株大多數(shù)為丙二酸克羅諾桿菌和阪崎克羅諾桿菌。關(guān)于廣泛克羅諾桿菌及蘇黎世克羅諾桿菌報道很少，其余3種菌株為環(huán)境共生菌故臨床意義不大［11-12］。目前對CS的檢測方法有微生物學(xué)檢測法、分子學(xué)檢測法、免疫學(xué)檢測法等。傳統(tǒng)微生物檢測法主要包括DFI法［13］、三管法［14］；分子生物學(xué)檢測主要包括PCR、熒光定量PCR、LAMP環(huán)等溫擴(kuò)增；免疫學(xué)檢測法主要包括膠體金免疫層析檢測、酶聯(lián)免疫檢測、間接免疫熒光檢測、免疫磁珠富集技術(shù)等。傳統(tǒng)微生物檢測耗時長、操作繁瑣，分子生物學(xué)檢測花費(fèi)大、樣品前處理時間長，而免疫學(xué)檢測靈敏度高、耗時短、特異性強(qiáng)且操作簡便。單克隆抗體技術(shù)是一種重要的免疫學(xué)技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于抗原的鑒定［15］，此技術(shù)具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以CS為免疫原制備抗CS單克隆抗體，可為該菌的防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株、細(xì)胞和動物

阪崎克羅諾桿菌（ATCC21550、ATCC21561、ATCC21552、CMCC1.6765）、莫氏克羅諾桿菌CICC23943、蘇黎世克羅諾桿菌CICC24178、都柏林克羅諾桿菌CICC21564、廣泛克羅諾桿菌CICC21570、丙二酸克羅諾桿菌CICC21551、單增李斯特菌CICC21635、鼠傷寒沙門菌CMCC10248、副溶血弧菌、大腸桿菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、普通變形桿菌、骨髓瘤細(xì)胞均由上海獸醫(yī)研究所C301實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c及KM小鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG 6 000購自美國Sigma公司；DMEM購自Gibco公司，南美特級胎牛血清及TSB肉湯購自上海秋爽生物科技有限公司；青鏈霉素混合液及L-谷氨酰胺購自北京索萊寶科技有限公司；次黃嘌呤（Hypoxanthine）、氨基喋呤（Aminopterin）、胸腺嘧啶核苷（Thymeidine）購自上海Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)板及酶標(biāo)板購自美國Corning公司；亞型鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司。

1.1.3 試驗(yàn)引物

根據(jù)參考文獻(xiàn)［16］-［19］中已報道的CS特異性鑒定引物，篩選出4對并由北京擎科生物科技上海分公司合成，其序列見表1。

表1 4對特異性引物序列

1.1.4 主要儀器

倒置顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；乳化儀購自Amalgamator公司；臺式低溫離心機(jī)購自Thermo Fisher科技有限公司；電子分析天平購自美國Mettler Toledo公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌的復(fù)蘇、純化、鑒定

將4株CS（ATCC21550、ATCC21561、ATCC21552、CMCC1.6765）轉(zhuǎn)接于TSB肉湯，37℃恒溫?fù)u床（200 r/min）增菌18 h。增菌完成后，將菌液用劃線法接種于TSA平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，以增菌→劃線接種的方式純化5代。第5代菌落增菌至OD600=1時，平板計(jì)數(shù)法［20］計(jì)此狀態(tài)活菌數(shù)。將上述4株CS各取1 mL菌液，提取基因組后PCR鑒定并測序。

1.2.2 抗原制備及免疫動物

把增菌至OD600=1的4株菌的菌液（ATCC21550、ATCC21561、ATCC21552、CMCC1.6765）各 加 入0.3%甲醛滅活后等比例混勻，用無菌1×PBS洗脫甲醛5次（12 000 r/min，3 min），然后用0.9%NaCl生理鹽水將菌液濃度調(diào)整為1×1010CFU/mL。

將制備的200 μL免疫原（滅活細(xì)菌量為2×109CFU）與200 μL弗氏完全佐劑混勻后乳化，免疫小鼠足墊；2周后第2次免疫，免疫量為1×109CFU，選用弗氏不完全佐劑乳化，免疫小鼠背部皮下；第3～5次免疫與第2次免疫一致，共免疫3只BALB/c小鼠。

1.2.3 間接ELISA法測定血清效價

對免疫后7 d小鼠采集血清，將血清二倍比稀釋至128 000倍，利用間接ELISA法測定血清效價。步驟：把濃度為2×109CFU/mL菌懸液37℃包被4 h或4℃包被12 h；用1%明膠37℃封閉2 h；加入100 μL稀釋后的血清37℃孵育1.5 h或4℃孵育12 h；加入100 μL 10 000倍稀釋的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h；加入100 μL底物顯色液37 ℃反應(yīng)15 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；多功能酶標(biāo)儀讀取OD450值，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為P/N≥2.1且OD450>1。

1.2.4 細(xì)胞融合

選取血清效價最高的小鼠，取脾臟細(xì)胞與均一、明亮、圓潤、長勢快的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。步驟：將骨髓瘤細(xì)胞和脾臟懸液轉(zhuǎn)移至融合管內(nèi)離心（1 000 r/min，8 min），棄掉上清；取1 mL融合劑PEG于45 s內(nèi)均勻加入融合管內(nèi)，反應(yīng)90 s；細(xì)胞融合終止：30 s內(nèi)均勻加入1 mL DMEM；30 s內(nèi)均勻加入2 mL DMEM；2 min內(nèi)快速加入10 mL DMEM。靜置后離心（1 000 r/min，10 min），用 10 mL 20%FBS DMEM（1%HAT）重懸，取1滴混于24 mL 20%FBS DMEM（1%HAT）中，滴入預(yù)先鋪布飼養(yǎng)層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于第3～5 d觀察。

1.2.5 細(xì)胞株篩選及亞克隆

細(xì)胞株篩選步驟與血清效價測定步驟一致。陽性瘤細(xì)胞株亞克隆步驟：把陽性瘤細(xì)胞懸液二倍稀釋8～10梯度，靜置5～10 min，計(jì)細(xì)胞數(shù)；選擇計(jì)數(shù)結(jié)果為100～150的細(xì)胞懸液混于10 mL 20%FBS DMEM（1%HAT）中，均勻鋪布至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；剩余細(xì)胞懸液保留，備用。

1.2.6 單克隆抗體腹水制備

對同批健康BALB/c小鼠腹腔連續(xù)注射2次0.5 mg滅菌石蠟油，間隔為1周。第3周對每只小鼠腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，采用體內(nèi)誘生法［21］誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水。小鼠腹水的處理：腹水常溫靜置2～4 h或4℃靜置過夜后離心（1 000 r/min，30 min），抽取中層腹水，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 單克隆抗體效價測定

梯度稀釋單克隆抗體，結(jié)合間接ELISA測定抗體效價，步驟同血清效價測定。

1.2.8 抗體特異性測定

將單增李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌、莫氏克羅諾桿菌、廣泛克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌作為ELISA包被原，將抗CS單克隆抗體稀釋至1∶20 000，測其與上述菌株的交叉反應(yīng)，步驟同血清效價測定。

1.2.9 抗體亞型測定

根據(jù)SBA Clonotyping System-HRP抗體亞型鑒定試劑盒說明書步驟，利用ELISA測定抗體亞型。抗體稀釋液為5%FBS PBST，亞型試劑稀釋液為1%BSA PBST。

1.2.10 抗原表位測定

包被及封閉完成后，用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記2H2抗體，加50 μL酶標(biāo)抗體（1∶500）及50 μL 不同梯度稀釋的9D10抗體，對照孔加入100 μL 2H2酶標(biāo)抗體（1∶1 000），37 ℃孵育2 h；加入100 μL底物顯色液 37 ℃反應(yīng) 15 min，用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；多功能酶標(biāo)儀讀取OD450值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

將純化后的4株CS增菌至OD600=1時，其3組平行菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示，計(jì)數(shù)結(jié)果均為2×109CFU/mL。

圖1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 鑒定結(jié)果

4對CS特異性引物擴(kuò)增片段分別為149 bp、282 bp、469 bp、952 bp，PCR鑒定后條帶大小均正確，將產(chǎn)物純化后測序，比對測序結(jié)果表明4株菌株均為CS，PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2 CS特異性引物鑒定結(jié)果

2.3 免疫血清效價

采集3只小鼠經(jīng)5次免疫后7 d的血清，把血清梯度稀釋后，利用間接ELISA測其血清效價，結(jié)果如表2所示，3只小鼠血清效價均可達(dá)32 000。

表2 5次免疫后3只小鼠血清效價

2.4 亞克隆及篩選

如圖3所示，細(xì)胞融合后5 d細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞圓潤、均一，細(xì)胞團(tuán)大小適中，呈葡萄串狀。選擇此狀態(tài)下的培養(yǎng)基上清用間接ELISA測定其效價并且對陽性孔換新培養(yǎng)基3 d后復(fù)檢，復(fù)檢陽性孔進(jìn)行亞克隆。本試驗(yàn)共計(jì)4次亞克隆，第1次亞克隆陽性率為37.5%；第2次亞克隆陽性率為48.9%；第3次亞克隆陽性率為72.9%；第4次亞克隆陽性率93.8%，經(jīng)4次克隆成功篩選出2株抗體效價高且特異性好的細(xì)胞株，根據(jù)融合板坐標(biāo)，分別命名為2H2、9D10。

圖3 細(xì)胞融合后5 d瘤細(xì)胞團(tuán)

2.5 單克隆抗體腹水效價

取1 μL單克隆抗體腹水將其梯度稀釋，利用間接ELISA測定OD450值，P/N≥2.1且OD450>1判定為陽性，圖4中a圖與b圖N值分別為0.083和0.082。如圖4所示，2H2抗體腹水效價為6 000 000；9D10抗體腹水效價為2 000 000。

圖4 2株單克隆抗體腹水效價

2.6 單克隆抗體特異性試驗(yàn)

如圖5所示，稀釋20 000倍的2株抗體與單增李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌、莫氏克羅諾桿菌、廣泛克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌均無交叉反應(yīng)，阪崎克羅諾桿菌為陽性對照，由此表明9D10抗體和2H2抗體特異性良好。

圖5 2株單克隆抗體特異性

2.7 亞型鑒定結(jié)果

單克隆抗體共計(jì)有6種重鏈亞型，分別為IgA、IgM、IgG2a、IgG1、IgG3、IgG2b；有2種輕鏈亞型，分別為 Lambda、Kappa。經(jīng) SBA Clonotyping System-HRP抗體亞型試劑盒鑒定，2H2抗體及9D10抗體重鏈均為IgG2a，2株抗體輕鏈均為Kappa，如表3所示。

表3 2株單克隆抗體亞型測定結(jié)果

2.8 單克隆抗體競爭ELISA試驗(yàn)

競爭ELISA結(jié)果如圖6所示，未經(jīng)HRP標(biāo)記的9D10抗體加入后，與對照組OD450值差異不顯著，表明9D10抗體與2H2抗體針對CS不同抗原表位。

圖6 2株單克隆抗體競爭ELISA結(jié)果

3 討論

CS引起的疾病發(fā)病率不算很高，但致死率極高［22］。該菌是食源性致病菌檢測的重點(diǎn)，免疫學(xué)方法是檢測該菌的方式之一［5］。單克隆抗體技術(shù)是免疫學(xué)工作中經(jīng)常采用的一種技術(shù)［15］，此技術(shù)具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。在單抗制備中免疫程序起著重要的作用，一般采用8～12周齡BALB/c小鼠免疫。免疫原制備選用甲醛滅活，制作成顆粒性抗原，這是由于顆粒性抗原比可溶性抗原有更好的免疫原性，從而讓小鼠有更好的免疫效果。選擇4種CS等量混合免疫，避免因個別菌種差異導(dǎo)致單克隆抗體針對的抗原表位差異太大，以保證抗CS單克隆抗體的均一。因初步融合細(xì)胞較為脆弱，需要提取KM小鼠腹腔內(nèi)的細(xì)胞鋪布融合細(xì)胞飼養(yǎng)層。陽性細(xì)胞株需要進(jìn)一步克隆時應(yīng)趁早，避免細(xì)胞團(tuán)塊太多造成無效克隆。另外因?yàn)榧?xì)胞的生長較為苛刻，所以應(yīng)及時關(guān)注細(xì)胞狀態(tài)，避免因?yàn)橹饔^原因（CO2不足、H2O不足、溫度變化）而造成細(xì)胞狀態(tài)不好甚至死亡。

本研究制備的2株抗體，采用的是P/N≥2.1且OD450>1雙重判斷標(biāo)準(zhǔn)，9D10抗體和2H2抗體效價分別為2×106和6×106。其他文獻(xiàn)報道的研究中抗CS單克隆抗體效價分別為 50 000［23］、100 000［5］、200 000［24］，相比而言，本試驗(yàn)制備的單抗腹水效價相對較高。特異性試驗(yàn)表明，9D10與2H2單抗對常見的其他食源性致病菌如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌等均無交叉反應(yīng)?？肆_諾桿菌屬7個種之間同源性較高，相互之間容易產(chǎn)生抗原交叉［25-26］，而本試驗(yàn)制備的2株抗體與克羅諾菌屬其他菌種均無交叉反應(yīng)，這說明2株抗體種屬間特異性較好，可以用于克羅諾桿菌屬中CS的鑒別診斷。亞型鑒定結(jié)果表明，本試驗(yàn)2株抗體的重鏈均為IgG2a，輕鏈均為Kappa，其他文獻(xiàn)報道的研究中抗CS單克隆抗體重鏈也多為IgG型，輕鏈多為Kappa型［23-24,27-28］。Ig主要在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒產(chǎn)生的抗體類型，多數(shù)為IgG型抗體，IgG是唯一能通過胎盤的免疫球蛋白，在嬰兒期能夠起到很好的防御作用，還有中和細(xì)菌、毒素，結(jié)合微生物促成吞噬作用，激活補(bǔ)體等作用［15］。因此，本研究獲得的2株單抗將來可用于CS的治療研究。此外，可以利用單抗捕獲細(xì)菌，如楊柳等[29]利用磁珠耦連抗CS單克隆抗體，富集環(huán)境中存在的CS，也可以利用單抗建立檢測方法，如向雙林等[5]以2株抗CS單克隆抗體分別作為捕捉抗體和檢測抗體，建立雙抗夾心ELISA方法，檢測限度可達(dá)103CFU·mL-1。本研究利用HRP對抗體標(biāo)記，通過競爭ELISA法測定2株抗體抗原表位競爭性，結(jié)果表明這2株抗體針對CS不同的抗原表位，可為將來建立檢測CS的免疫學(xué)檢測方法提供基礎(chǔ)，如雙抗夾心ELISA法。

4 結(jié)論

綜上，本研究成功制備出2株抗CS單克隆抗體9D10抗體和2H2抗體，效價均超過一百萬，2株抗體效價分別為2×106、6×106；2株抗體的特異性均較好，不僅與常見的食源性細(xì)菌，如大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門菌等無交叉反應(yīng)，與CS同屬的5種其他菌，如蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌等也均無交叉反應(yīng)；2株抗體的重鏈均為IgG2a，輕鏈均為Kappa；2株抗體針對CS不同的抗原表位。抗CS單抗的成功制備，為后續(xù)針對CS的檢測與治療技術(shù)研究打下了很好的基礎(chǔ)。