許濤，劉瑞鑫，賈瑜艷，方雷，李楊輝，周小玲*，于治成

（1塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（3新疆阿勒泰地區(qū)青河縣夢圓生物科技有限公司，新疆 青河 836200）

驢乳中活性物質(zhì)豐富，具有防治心血管疾病、抗疲勞、抗腫瘤的作用［1］，還具有抗菌、抑菌、提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、潤膚美容、輔助治療和食療康復(fù)等作用［2］，近年來越來越多的國內(nèi)外學(xué)者參與到有關(guān)驢乳及驢乳制品的研究中［3-8］。有研究表明，驢乳平均水分含量為90%、脂肪含量為0.28%～2.00%、蛋白質(zhì)含量為1.2%～2.0%、乳糖含量為5.8%～7.4%、灰分含量為 0.4%～0.5%［4］。與牛乳、羊乳、駱駝乳相比，驢乳中蛋白質(zhì)、乳糖含量與人乳更為接近，具有致敏性較低、能增強(qiáng)免疫力等特點(diǎn)［2,9］。驢乳的脂肪酸組成與人乳脂肪酸組成比較接近［10］，含有豐富的人體必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）。驢乳中所含多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）n-3略高于人乳，遠(yuǎn)高于牛乳；驢乳中α-亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA）百分比含量遠(yuǎn)高于人乳和牛乳，亞油酸（linoleic acid，LA）百分比含量和人乳較為接近，高于牛乳；驢乳中花生四烯酸（arachidonic acid，AA）百分比含量遠(yuǎn)低于人乳和牛乳，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）百分比含量高于人乳和牛乳，因此造成了驢乳較低的PUFA n-3/n-6和AA/EPA比值，適合牛奶蛋白過敏嬰幼兒食用［11］。

氣相色譜法因其高效的分離效能和靈敏的檢測限，成為脂肪酸分析的常用技術(shù)，在乳脂肪酸分析中應(yīng)用廣泛。關(guān)于驢乳脂肪酸的定性定量檢測近年來也有報道，如張巖春等［10］采用氣相色譜法分析測定了驢乳；于靜等［12］采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用分析生鮮驢乳；錢宗耀等［13］采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定驢乳粉。但由于飼養(yǎng)條件不同，乳汁營養(yǎng)成分不同，造成檢測結(jié)果有差異，因此，有必要研究本地新疆驢驢乳樣品。本試驗利用島津GC-2014C氣相色譜儀，以37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品為基礎(chǔ)，建立定性分析乳中脂肪酸、峰面積外標(biāo)法和定量測定驢乳中脂肪酸含量的分析方法，并對測定結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度進(jìn)行評價，以期為驢乳脂肪酸檢測方法提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物為塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地飼養(yǎng)的新疆驢，樣品采自5頭同一飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下處于泌乳中期的母驢，手工擠奶并經(jīng)四層棉質(zhì)紗布過濾后，樣品置于-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品：37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，詳見表1。

表1 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品及其中英文名稱

續(xù)表1

試劑：正己烷（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），鹽酸、己酸、庚酸、辛酸、甲醇均為分析純試劑（成都西隴化學(xué)試劑玻璃儀器有限公司）。

儀器：GC-2014C氣相色譜儀（日本島津儀器有限公司），AL204電子天平（上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州邁科諾儀器有限公司），H2050R-1臺式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），H2050R高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取乳脂

稱取驢乳樣品40 mL置于50 mL離心管中，以6 000 r/min離心30 min，吸出上層奶油后置于5 mL離心管中，以15 000 r/min冷凍離心30 min，在冰水中取出上層奶油。

1.2.2 乳脂皂化酯化

1）氫氧化鈉-甲醇溶液（0.5 mol/L）：稱取2 g氫氧化鈉，用甲醇溶解并定容至100 mL，混勻。

2）鹽酸-甲醇溶液（5 vt%）：取5 mL鹽酸，用甲醇定容至100 mL，混勻。

3）提取的驢乳奶油在室溫融化后，吸取100 μL于具塞玻璃管中，加入6 mL氫氧化鈉-甲醇溶液，置于60℃下水浴15 min，再加入6 mL鹽酸-甲醇溶液，在80℃下水浴60 min，冷卻至室溫后，最后加入5 mL蒸餾水和5 mL正己烷，振搖，靜置分層后，取上清液2 mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，放入進(jìn)樣瓶中，進(jìn)氣相色譜儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：CP-sil88，100 m×0.25 mm×0.2 μm；檢測器：FID，260 ℃；入口壓力：200 kPa；色譜柱流量：N21.0 mL/min；分流比（30:1）；進(jìn)樣口：230℃。

程序升溫：初始溫度70℃，保持4 min，以13℃/min的速度上升至175℃，保持27 min，以4℃/min的速度上升至210℃，保持8 min，最后以5℃/min的速度上升至230℃，保持13 min，程序共72.83 min，可使37種脂肪酸完全分離。

1.3 脂肪酸定性、定量分析方法的建立

1.3.1 定性分析

驢乳樣品中脂肪酸的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的保留時間進(jìn)行比較，來確定各脂肪酸的峰位。

1.3.2 定量分析

以正己烷為溶劑將37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品配制成稀釋液，分別為原液濃度的1/10、2/10、4/10、6/10和8/10。取1.0 μL進(jìn)氣相色譜儀分析，連續(xù)多次測定，采用峰面積外標(biāo)法，建立線性回歸方程。

1.3.3 精密度、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率

精密度計算：在重復(fù)條件下獲得兩次獨(dú)立的測定結(jié)果的絕對差值與算術(shù)平均值之比，以不超過算術(shù)平均值的15%為標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)參考GB/5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》［14］。

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）：所測樣品含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差/所測樣品含量的平均值×100。

回收率計算：在測定樣品時，于同一樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測定，將測定結(jié)果扣除樣品的測定值，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的定性、定量分析

2.1.1 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的定性分析

37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸保留時間及定性結(jié)果如圖1所示。分離度（R）是評價色譜柱總分離效能的指標(biāo)，R值越大分離越完全，通常R≥1.5表示相鄰兩峰完全分離。若樣品峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時間差小于0.1 min，則定性為同一種脂肪酸［15］。通過計算和出峰圖綜合分析，該標(biāo)準(zhǔn)品分離完全，此分析方式可作為一種定性分析乳中脂肪酸的較為準(zhǔn)確的方法。

圖1 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸色譜圖

2.1.2 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的定量分析

37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的定量結(jié)果如表2所示，在所選濃度范圍內(nèi)，各脂肪酸工作曲線的相關(guān)系數(shù)r>0.997，說明在該濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性相關(guān)性較好。RSD值介于0.29%～4.88%之間，說明該方法能有效地定量測定驢乳中各脂肪酸濃度，重復(fù)性較好；精密度介于0.37%～6.89%之間，表明此方法的精密度較高，可滿足精確測量的要求?；厥章试?0.43%～110.78%之間；表明該方法準(zhǔn)確度高，可有效測定驢乳中各脂肪酸濃度?？傮w來說，該方法所測結(jié)果重復(fù)性、精密度、準(zhǔn)確度都可滿足測試要求，可用于后續(xù)驢乳脂肪酸定量測定。

表2 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品中脂肪酸的線性特征、RSD、精密度和回收率

續(xù)表2

2.2 驢乳樣品中脂肪酸的定性、定量測定

由表3可知，從驢乳中檢測出C6:0、C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C13:0、C14:0、C14:1、C15:0、C16:0、C16:1、C17:1、C18:0、C18:ln9c、C18:2n6c、C20:1、C18:3n-6共17種脂肪酸，但各樣品中脂肪酸種類和含量存在較大差異。其余20種脂肪酸在本試驗驢乳樣本中并未檢出或含量甚微。

表3中從各脂肪酸的組成來看，乳樣5含量明顯高于其余4個樣本，推測與乳樣5的母驢采食及產(chǎn)奶量相關(guān)。在試驗過程中，個別母驢會出現(xiàn)喜愛吃粗飼料，對精料采食較少的情況。而驢是單胃草食動物，粗飼料中中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）所占比例較高，在驢后腸經(jīng)微生物作用下轉(zhuǎn)化為乙酸為主的短鏈脂肪酸（SCFA）［16］，乙酸是生脂前體物［17］，有利于乳脂的合成［18-19］，這樣會造成乳中乳脂比例較高，產(chǎn)奶量相對較低的現(xiàn)象，從而改變?nèi)槌煞趾?，類似的現(xiàn)象在馬乳［20-21］中也有報道。因此我們認(rèn)為乳樣5各脂肪酸含量高，與驢飼料營養(yǎng)因素有關(guān)。

表3 驢乳樣品脂肪酸組成及含量

驢乳中以C8:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:ln9c、C18:2n6c這7種為主，尤其以C18:2n6c為多，平均占比為20.6%，這與張巖春等［10］、豆智華等［22］報道結(jié)果相近。從飽和脂肪酸上來看，以C10:0、C12:0、C14:0和C16:0為主，而其中C10:0～C14:0稱為中鏈飽和脂肪酸，此類脂肪酸可直接被小腸吸收為機(jī)體供能［23］；另外月桂酸（C12:0）在體內(nèi)被認(rèn)為具有抗病毒和抗菌能力；肉豆蔻酸（C14:0）可以同時提高LDL-C和HDL-C的含量；棕櫚酸（C16:0）能調(diào)節(jié)人體脂肪的形成［24］，并且還有抗炎、調(diào)節(jié)糖尿病患者胰島素分泌等功能［25］。在本研究中，不飽和脂肪酸中以亞油酸（C18:2n6c）和油酸（C18:ln9c）為主，分別占15.57%和20.6%，這與豆智華等［22］的報道相近。亞油酸具有“血管清道夫”稱號，可降低人體血液中膽固醇和甘油三酯等［26］，在醫(yī)學(xué)和食品健康領(lǐng)域受到廣泛重視。油酸可促進(jìn)傷口愈合，且具有降血糖，調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)心臟等作用［27］。UFA/SFA比值是反映食品中脂肪酸營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)，本研究測得驢乳樣本中UFA/SFA比值為0.63，這與張巖春等［10］、豆智華等［22］

人報道結(jié)果不同，均小于他們所得結(jié)果，但與敖維平等［28］報道結(jié)果接近。其原因可能與飼養(yǎng)管理或個體差異有關(guān)，MARTINI M等［29］也曾對驢乳中UFA/SFA值個體差異較大有過報道。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用外標(biāo)法，以37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品為基礎(chǔ)，建立了定性、定量分析驢乳中脂肪酸的分析方法。該方法具有較好的準(zhǔn)確性和精密度，能有效地分離驢乳中各脂肪酸。采用該方法可較好地從驢乳脂肪中分離出17種脂肪酸樣本，其中亞油酸（C18:2n6c）占20.6%，月桂酸（C12:0）占15.78%，油酸（C18:1n9c）占 15.57%，癸酸（C10:0）占 14.34%，棕櫚酸（C16:0）占14.09%，肉豆蔻酸（C14:0）占9.64%，表明此方法適用于驢乳脂肪酸的分析。