劉光磊

INS 是小兒常見的腎臟疾病,以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和浮腫為其臨床特征［1］。微小病變型腎病為INS 主要原因,本病發(fā)病機制仍不清楚,對糖皮質激素及實驗研究提示本病為免疫介導［2］,但其中的因果關系尚待進一步探討。近年來有研究發(fā)現(xiàn)INS患兒外周血中Treg 比例下調［3］,但導致Treg 細胞比例下調的機制仍不清楚,需進一步研究,本文系統(tǒng)觀察急性期和緩解期INS 患兒Treg 細胞比例和Th2 細胞比例動態(tài)變化,檢測參與調控Treg 細胞分化的miRNA 變化,旨在進一步闡明INS 發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年1 月～2021 年12 月本院治療的40 例激素敏感型INS 患兒為研究對象,其中男27 例,女13 例；平均年齡(39.0±10)個月。根據(jù)病情將患兒分為INS 初發(fā)組和INS 緩解組,各20 例。另選取同年齡健康體檢兒童20 例作為對照組。三組性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。本研究已通過遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象的監(jiān)護人均已知情和同意。

表1 三組一般資料比較［n(%),］

表1 三組一般資料比較［n(%),］

注：三組比較,P＞0.05

1.2 納入、排除及診斷標準 納入標準：符合INS 的診斷標準；激素敏感型INS 患兒。排除標準：先天性腎病綜合征、狼瘡性腎炎及紫癜性腎炎等繼發(fā)性腎病綜合征、腎炎性腎病綜合征。診斷標準：①INS 診斷標準：根據(jù)2016 年《兒童激素敏感、復發(fā)/依賴腎病綜合征診治循證指南》對INS 進行診斷［4］；②激素敏感型INS：是指采用足量強的松,未使用其他免疫抑制劑聯(lián)合治療,并且治療8 周內尿蛋白轉陰的INS；③INS 初發(fā)患兒：是首次患病的INS 患兒；④INS 緩解患兒：停用強的松治療＞4 周,并且血液生化監(jiān)測指標及尿液常規(guī)檢查均正常的INS 患兒。

1.3 方法 INS 初發(fā)患兒在應用激素前、緩解患兒在達到緩解標準后4 周、對照組在健康體檢時均于肘部一次性抽取靜脈血3 ml 進行以下檢測。①采用流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測受試兒外周血單個核細胞(PBMC)中循環(huán)Treg 細胞比例：以CD4-FITC(流式抗體均購自美國eBio-science 公司)設門,經(jīng)CD4-FITC、CD25-APC 染色30 min 后經(jīng)固定破膜后加入Foxp3-PE,孵育30 min 后上機檢測Treg。②實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)檢測miRNA：按試劑盒說明書(美國Invitrogen 公司)步驟分離T淋巴細胞總RNA,紫外分光光度計測定RNA 含量及純 度SYBRGreen 試劑盒(德國QIAGen,218073),羅氏(Light Cycler 480)PCR 儀熒光定量檢測miRNA155、miRNA21、miRNA31 的表達。

1.4 觀察指標 比較外周血中Treg 細胞百分比、Th2細胞百分比及Treg 分化相關miRNA(miRNA155 基因、miRNA21 基因、miRNA31 基因)水平。分析外周血Treg、Th2 細胞百分比的相關性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,正態(tài)計量資料采用t檢驗,非正態(tài)計量資料采用F檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關性采用Pearson相關分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組Treg 細胞百分比及Treg 分化相關miRNA表達水平比較 INS 初發(fā)組患兒外周血Treg 細胞百分比(3.45±1.88)% 低于對照組的(5.99±2.01)%及INS 緩解組的(5.62±1.44)%,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；INS 初發(fā)組患兒外周血Th2 細胞百分比(4.58±1.35)% 高于對照組的(3.43±1.03)% 及INS 緩解組的(3.69±1.24)%,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；INS 初發(fā)組患兒miRNA155 基因表達(27.70±12.30)×10-5低于對照組的(51.62±18.70)×10-5及INS緩解組的(36.36±16.10)×10-5,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；INS 緩解組與對照組miRNA155 基因表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；INS 初發(fā)組患兒miRNA21 基因表達(15.88±3.58)×10-5低于對照組的(26.04±4.54)×10-5及INS緩解組的(23.09±4.29)×10-5,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；INS 緩解組與對照組miRNA21 基因表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；INS 初發(fā)組患兒miRNA31 基因表達(20.63±6.45)×10-5高于對照組的(13.37±4.38)×10-5及INS 緩解組的(15.47±3.29)×10-5,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；INS 緩解組與對照組miRNA31 基因表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 三組外周血Treg、Th2 細胞百分比及相關miRNA 表達水平比較()

表2 三組外周血Treg、Th2 細胞百分比及相關miRNA 表達水平比較()

注：與INS 初發(fā)組比較,aP＜0.05

2.2 外周血Treg、Th2 細胞百分比的相關性分析 相關性分析結果顯示,外周血Treg 百分比與Th2 細胞百分比呈負相關關系(r=-0.527,P＜0.05)。見圖1。

圖1 外周血Treg 細胞百分比與Th2 細胞百分比關系散點圖

3 討論

INS 發(fā)病多為學齡期前兒童,3～5 歲為發(fā)病高峰,約80%～90%年齡＜10 歲的INS 患兒屬于微小病變型［1］。本病發(fā)病機制仍不清楚,對糖皮質激素及實驗研究提示本病為免疫介導特別是T 細胞的功能異常所致［2］。早在1959 年就有報道,花粉過敏癥與季節(jié)性蛋白尿的關系［5］,并且約30%的INS 患兒合并有過敏鼻炎、特發(fā)性皮炎等特應性表現(xiàn),部分研究還證實INS患兒活動期免疫球蛋白(Ig)E 增高,特別是反復復發(fā)患兒更為明顯［6］。已知Th2 分泌的白細胞介素(IL)-13、IL-4 促進B 細胞IgE 的產生,在過敏反應中發(fā)揮重要作用。并且近年來有研究表明,活動期INS 患兒外周血中Th2 比例升高、血漿中IL-13、IL-4 濃度增高［7］。

眾所周知,Treg 細胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著免疫調節(jié)功能,對Th2 細胞等有抑制作用［8,9］。且以往已有報道INS 急性期Treg 比例下調［3］,并且2011 年Michiko等提出二次打擊學說,即血清IL-13、內毒素或抗原等作用于腎小球,導致足細胞CD80 的過表達,進而出現(xiàn)暫時蛋白尿,此為第一次打擊,如果此時能夠解除對足細胞的刺激因素,抑制CD80 的過分表達,尿蛋白將會消失,但INS 患兒由于Treg 下調,不能分泌足夠的可溶性細胞毒性T 淋巴相關抗原(sCTLA-4)、IL-10 等抑制CD80 表達的細胞因子,導致CD80 的持續(xù)過表達,進而出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿的產生,此為第二打擊［10］。因此本文進一步檢測了各組外周血中Treg 細胞比例和Th2細胞的比例,結果表明,初發(fā)期INS 患兒外周血中Treg細胞比例呈明顯下降趨勢,而初發(fā)期患兒Th2 細胞比例均明顯增高。而在在緩解期INS 患兒,Treg 細胞比例呈明顯上升趨勢,Th2 細胞比例均明顯下降,這與以往的研究結果相同［7］。而進一步通過相關關系分析發(fā)現(xiàn),各組外周血Treg 細胞與Th2 細胞比例之間呈明顯負相關關系(P＜0.05),也就是說隨著Treg 細胞比例的下降,Th2 細胞呈明顯上升趨勢,因此Treg 細胞比例下降可能INS 發(fā)病的重要原因。

早期有學者認為Treg 細胞的下降可能與細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-2 的紊亂有關,但研究表明,INS 患兒血漿中TNF-α 呈增高趨勢,而IL-1β、IL-2 是否增高仍存在爭議,因此通過體液中細胞因子的改變解釋Treg 下降證據(jù)尚不充分［11-13］,何種原因導致Treg 下降仍需進一步探討。

miRNA 是一種內源性的、非編碼蛋白質的單鏈小分子RNA,通過干擾靶向信使RNA(mRNA)的穩(wěn)定或翻譯抑制蛋白質的合成,從而調控基因表達［14］。研究已證實miRNA155、miRNA21 信號途徑和miRNA31可分別上調或下調Treg 特異性標志之一的Foxp3 表達［15,16］,而Foxp3 是Treg 發(fā)育的重要調節(jié)因子,因此,miRNA155、miRNA21 信號途徑和miRNA31 可能共同參與調控Treg 細胞［17-20］。因此本文進一步檢測參與調控Treg 細胞分化的miRNA,結果提示在活動期INS 患兒中,上調Treg 細胞功能的miRNA155、miRNA21 呈明顯下降趨勢,而下調Treg 細胞功能的miRNA31 則呈明顯上升趨勢,提示Treg 細胞比例下降可能與miRNA155、miRNA21、miRNA31 的異常表達有關。本研究顯示,恢復期INS 患兒Treg 細胞比例、Th2 細胞比例已恢復到接近正常水平,而miRNA155、miRNA21 基因表達也下調至接近正常對照組的水平,而同時miRNA31 基因表達也上調至接近正常對照組的水平,表明初發(fā)期INS 患兒 miRNA 表達異?？赡苁菍е录毙云赥reg 細胞數(shù)量下調的原因之一。

綜上所述,初發(fā)期INS 患兒Treg 細胞下調可能與miRNA 的異常表達有關,由于研究方法與對象的局限,INS 患兒Treg 細胞相關miRNA 異常表達的具體機制尚需進一步研究。