洪琴， 王婭， 粟鳳， 甘昌玉， 達(dá)靜靜， 胡建軍**

(1.貴州省人民醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽 550001； 2.貴州省人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 貴州 貴陽 550001)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)1968年被Berger和Hinglais首次描述和命名，其特點(diǎn)是腎小球系膜區(qū)有IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積，免疫復(fù)合物由聚合IgA1(a IgA1)和補(bǔ)體3(C3)組成，亦還有可變的IgG和/或IgM共沉積[1]。IgAN是全球最常見的腎小球腎炎，是慢性腎病和終末期腎功能衰竭(ESRD)的重要原因，嚴(yán)重危害人類健康[2]。IgAN發(fā)病機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為是多種機(jī)制作用的結(jié)果，提出“四重打擊學(xué)說”：第一重打擊，lgAN患者循環(huán)中存在高水平的半乳糖缺失的IgA1(Gd-IgA1)；第二重打擊，Gd-IgA1作為自身抗原誘發(fā)自身抗體的產(chǎn)生(抗糖抗體)；第三重打擊，抗糖抗體和半乳糖缺失的IgA1二者形成循環(huán)免疫復(fù)合物在腎臟沉積；第四重打擊，通過激活補(bǔ)體、誘發(fā)炎癥因子等途徑致腎組織損傷，導(dǎo)致IgA腎病的發(fā)病和進(jìn)展。目前認(rèn)為IgA1分子的糖基化異常造成IgA1易于自身聚集或被IgG或IgA識(shí)別形成“致病性”免疫復(fù)合物，可能是IgA腎病發(fā)病中的始動(dòng)因素[3]。新近研究提示，足細(xì)胞自噬異常是IgAN發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制[4]。自噬是由溶酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的降解過程，這個(gè)過程涉及清除衰老的細(xì)胞器和破壞性蛋白質(zhì)，同時(shí)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[5]。自噬參與了人類多種疾病的發(fā)病機(jī)制，越來越多證據(jù)表明，自噬參與了腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制[4]。足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障的重要細(xì)胞，位于腎小球毛細(xì)血管簇的表面，自噬與足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定密切相關(guān)，自噬功能的紊亂將導(dǎo)致足細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，是導(dǎo)致IgAN蛋白尿發(fā)生、發(fā)展以及ESRD的重要原因及關(guān)鍵因素[6]。在糖尿病患者和大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬不足伴有足細(xì)胞丟失的大量蛋白尿，在小鼠蛋白尿的進(jìn)展中具有因果關(guān)系[7]。此外，早期研究發(fā)現(xiàn)IgAN兒童患者足細(xì)胞存在兩種自噬類型(Ⅰ型、Ⅱ型)，Ⅰ型自噬(直徑約1 μm)表現(xiàn)為致密的核糖體區(qū)域和少量的脂滴，其限制膜起源于線粒體；Ⅱ型自噬(直徑3～8 μm)表現(xiàn)為一個(gè)濃縮的核糖體和許多脂滴，其限制膜起源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Ⅱ型自噬轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w和自噬泡，提示Ⅱ型自噬在清除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)方面比Ⅰ型自噬更重要，以Ⅰ型自噬為主的IgAN患者的病理損害程度更嚴(yán)重，預(yù)后較差[8-9]。研究顯示，IgAN成人患者足細(xì)胞中自噬體的數(shù)量較少，表明自噬參與足細(xì)胞損傷及IgAN的進(jìn)展[10]。本研究通過比較IgAN患者及腎結(jié)石患者足細(xì)胞自噬體數(shù)目的差異，同時(shí)觀察不同病理分級(jí)IgAN患者自噬體數(shù)目的變化，探究IgAN發(fā)展過程中足細(xì)胞自噬的作用。

1 資料與方法

1. 1 一般資料

收集2017—2020年有完整臨床資料并確診為原發(fā)性IgAN患者的腎組織石蠟標(biāo)本，分為IgAN1組(2017—2019年206例)和IgAN2組(2018—2020年30例)，選擇2020年腎結(jié)石患者石蠟標(biāo)本3例作為對(duì)照組。IgAN1組和IgAN2組的患者腎臟穿刺標(biāo)本腎小球≥6個(gè)，電鏡標(biāo)本腎小球≥1個(gè)。

1.2 方法及觀察指標(biāo)

1.2.1血清肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白 收集IgAN1組血清肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白定量數(shù)據(jù)，分析組內(nèi)不同性別患者3項(xiàng)指標(biāo)的差異。

1.2.2腎臟組織學(xué) 對(duì)照組及IgAN1組、IgAN2組腎臟組織石蠟包埋標(biāo)本均進(jìn)行切片，蘇木精-伊紅(HE)染色及六氨銀(PASM)染色，光鏡下觀察腎小球系膜區(qū)的增生情況、有無節(jié)段性硬化或球形硬化、有無新月體及腎小管萎縮。

1.2.3腎臟病理學(xué)分級(jí)及分組 由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對(duì)IgAN1組、IgAN2組進(jìn)行Haas病理分級(jí)，分為IgAN1組Hass Ⅰ～Ⅴ級(jí)組、IgAN2組Hass Ⅰ～Ⅴ級(jí)組。參考文獻(xiàn)[11]對(duì)腎活檢組織進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)，輕微病變型，僅見腎小球系膜區(qū)的輕微的系膜細(xì)胞增生、無節(jié)段性或球性硬化、無新月體；Ⅱ級(jí)，局灶節(jié)段性腎小球硬化樣型，與原發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)相似，無新月體；Ⅲ級(jí)，局灶增生型，不足50%的腎小球出現(xiàn)細(xì)胞增生，增生的細(xì)胞可以只限于系膜細(xì)胞，也可伴有內(nèi)皮細(xì)胞增生、主要以節(jié)段性分布為主，可以有少數(shù)新月體；Ⅳ級(jí)，彌漫增生型，超過50%的腎小球出現(xiàn)細(xì)胞增生，增生的細(xì)胞常為系膜細(xì)胞中度以上的增生，也可伴有內(nèi)皮細(xì)胞增生、多數(shù)彌漫性增生、部分節(jié)段性增生，可以有新月體；V級(jí)，進(jìn)行性慢性腎炎型，≥40%的腎小球呈現(xiàn)球性硬化，腎皮質(zhì)約40%的腎小管萎縮或消失。

1.2.4腎小球補(bǔ)體C3c及IgA免疫熒光沉積 免疫熒光顯微鏡觀察對(duì)照組及IgAN1組、IgAN2組HassⅠ-Ⅴ級(jí)組腎小球補(bǔ)體C3c及IgA免疫熒光沉積。免疫熒光顯示強(qiáng)度分為：“-”表示高、低倍鏡均不顯示沉淀，“±”表示高倍鏡隱約顯示沉積，“1+”表示低倍鏡隱約可見沉積、高倍鏡下可見沉積，“2+”表示低倍鏡下可見顯示沉積，高倍鏡下清晰顯示沉積，“3+”表示低倍鏡下清晰沉積、高倍鏡下耀眼沉積，“4+”表示低倍鏡下耀眼沉積、高倍鏡下刺眼的沉積。

1.2.5足細(xì)胞中自噬體 采用透射電鏡觀察對(duì)照組及IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組足細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的自噬體。電鏡下自噬體是由單層膜或雙層膜包裹的圓球形的結(jié)構(gòu)，每組每個(gè)病例隨機(jī)選取20個(gè)足細(xì)胞計(jì)數(shù)自噬體數(shù)量，每個(gè)足細(xì)胞取1～2個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)足細(xì)胞內(nèi)自噬體的平均數(shù)量，分析對(duì)照組及IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組各組間自噬體數(shù)量的變化趨勢(shì)，分析自噬體數(shù)量變化與病理分期的關(guān)系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IgAN1組各臨床指標(biāo)的差異及其性別特點(diǎn)

IgAN1組不同性別患者的血肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白定量比較，男性患者血肌酐更高，尿蛋白及24 h尿蛋白更多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示男性臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重，腎功能不全表現(xiàn)更顯著；見表1。IgAN1組Hass分級(jí)：Hass Ⅰ級(jí)67例，Hass Ⅱ級(jí)59例，Hass Ⅲ級(jí)31例，Hass Ⅳ級(jí)14例，Hass Ⅴ級(jí)35例；與HassⅤ級(jí)比較，HassⅠ級(jí)組患者尿蛋白及24 h尿蛋白定量增加，血肌酐降低(P<0.05)；見表2。

表1 IgAN1組不同性別患者尿蛋白及血肌酐比較Tab.1Comparison of urine protein and serum creatinine in IgAN1 patients between males and

2.2 腎臟組織學(xué)觀察

光鏡下觀察，對(duì)照組腎小球系膜區(qū)未見增寬，IgAN1組和IgAN2組腎小球系膜區(qū)增寬、系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞不同程度增生，可見節(jié)段性硬化及新月體形成，伴腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維組織增生、慢性炎細(xì)胞浸潤。

表2 不同病理分級(jí)IgAN1組患者尿蛋白及血肌酐比較Tab.2 Comparison of urine protein and serum creatinine in IgAN1 group between different pathological

2.3 腎臟病理學(xué)分級(jí)

HassⅠ級(jí)組腎小球系膜區(qū)輕度增寬，系膜基質(zhì)及細(xì)胞輕度增生；HassⅡ級(jí)組可見節(jié)段性硬化；HassⅢ級(jí)組局灶系膜基質(zhì)及細(xì)胞節(jié)段性中度加重伴內(nèi)皮細(xì)胞增生，可見節(jié)段性硬化，可見新月體形成；HassⅣ級(jí)組系膜基質(zhì)及細(xì)胞中度彌漫性增生，局灶節(jié)段性重度加重伴內(nèi)皮細(xì)胞增生，可見節(jié)段性硬化及球性硬化，可見新月體形成；HassⅤ級(jí)組可見≥40%腎小球球性硬化，伴腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維組織增生、慢性炎細(xì)胞浸潤。提示Hass分級(jí)越高，腎小球病變?cè)街?、越多樣。見圖1。

2.4 免疫熒光沉積

對(duì)照組腎小球未見IgA及C3c的免疫熒光反應(yīng)，IgAN1組、IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組腎小球均可見IgA、C3c在系膜區(qū)呈較強(qiáng)的團(tuán)塊狀綠色熒光沉積(≥2+)。見圖2。

注：光鏡下觀察腎小球系膜區(qū)有無增寬、系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞有無增生、有無節(jié)段性硬化及新月體形成、伴/不伴腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維組織增生以及慢性炎細(xì)胞浸潤情況。圖1 各組腎臟組織HE及PASM染色(HE，×400； PASM，×400)Fig.1 HE staining and PASM staining of renal tissues in each group (HE,×400; PASM,×400)

2.5 腎小球內(nèi)自噬體

電鏡下觀察對(duì)照組及IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組腎小球的超微結(jié)構(gòu)，均可見足細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的自噬體。與正常對(duì)照組比較，IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組患者的自噬體數(shù)量減少, 隨著IgAN2組Hass病理分級(jí)的進(jìn)展，自噬體數(shù)量隨著病理級(jí)別增加而增多(P<0.01)。見圖3和表3。

注：熒光顯微鏡下觀察腎小球系膜區(qū)有無IgA、C3c熒光沉積。圖2 各組腎小球免疫熒光C3c、IgA沉積(IF，×400)Fig.2 Immunofluorescent staining results showing glomerular C3c and IgA deposits in each group (IF,×400)

注：箭頭所示為自噬體。圖3 IgAN2組患者足細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)自噬體(透射電鏡，×20 000)Fig.3 Autophagosomes in podocyte cytoplasm in IgAN2 group (TEM,×20 000)

表3 各組腎小球足細(xì)胞自噬體數(shù)量比較Tab.3 Comparison of autophagosome numbers in glomerular podocytes between

3 討論

IgAN是腎小球基底膜中IgA型免疫球蛋白沉積引起的腎小球腎炎的常見形式之一，其臨床表現(xiàn)和進(jìn)展率取決于臨床病理表型和隨訪時(shí)間，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病為多打擊機(jī)制的結(jié)果[12-13]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，IgAN中足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一，目前研究其損傷機(jī)制包括補(bǔ)體系統(tǒng)激活、細(xì)胞因子改變、足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白(nephrin)蛋白異常、異常糖基化IgA1等，而足細(xì)胞自噬在上述損傷機(jī)制中起重要作用[14]。IgAN是我國最常見的腎小球腎炎，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的病因之一，約30%的IgAN患者在確診后10 ～20年進(jìn)展為腎功能衰竭[15]。因此研究IgAN的發(fā)病機(jī)制，探討并研制新的治療方案改善患者病情十分重要。

自噬是一種在真核細(xì)胞中高度保守的、用于降解和回收利用細(xì)胞長效生物大分子和受損細(xì)胞器的過程[16]，目前已知足細(xì)胞病變、IgA腎病、糖尿病腎病等多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展與自噬密切相關(guān)[6-10]。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞特異性缺失自噬相關(guān)因子Vps34的小鼠在9周后出現(xiàn)早期蛋白尿、進(jìn)行性腎小球硬化和腎功能衰竭[17]；腎臟缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因(Atg)5基因缺陷型足細(xì)胞不能進(jìn)行正常自噬，其氧化和泛素化蛋白的積累以及足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終導(dǎo)致蛋白尿增加和腎小球硬化[18]；在用a IgA1刺激的腎小球系膜細(xì)胞中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SUMO1可能通過抑制自噬來促進(jìn)其細(xì)胞增殖[19]；隨著系膜細(xì)胞增殖，IgAN血清中TGF-β1升高，TGF-β1抑制足細(xì)胞自噬并激活mTOR通路，即IgAN進(jìn)展時(shí)，TGF-β1可以激活mTORC1并抑制自噬，進(jìn)一步了解系膜細(xì)胞增殖導(dǎo)致足細(xì)胞功能障礙的機(jī)制[20]。新近研究發(fā)現(xiàn)[21]在FSGS患者的足細(xì)胞中自噬空泡數(shù)量減少，可以通過雷帕霉素誘導(dǎo)自噬來減少足細(xì)胞的損傷，同時(shí)，3-甲基腺嘌呤抑制自噬使大鼠對(duì)氨基核苷誘發(fā)的FSGS變得敏感，而雷帕霉素部分保護(hù)足細(xì)胞免受氨基核苷誘導(dǎo)的腎病的影響。

目前研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞自噬功能異常將導(dǎo)致足細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，是導(dǎo)致IgAN蛋白尿發(fā)生、發(fā)展的重要原因，本研究根據(jù)收集年限將有完整臨床資料并確診為原發(fā)性IgAN患者的腎組織石蠟標(biāo)本分為2017—2019年IgAN1組(206例)，根據(jù)Haas病理分級(jí)分為IgAN1組Hass Ⅰ～Ⅴ級(jí)組，比較IgAN1組Hass Ⅰ～Ⅴ級(jí)組各組間患者尿蛋白定量、24h尿蛋白定量及血肌酐的差異及其性別特點(diǎn)，由于所在科室2018年起開展電鏡檢測，故收集2018—2020年IgAN2組(30例)，選擇2020年腎結(jié)石患者石蠟標(biāo)本3例作為對(duì)照組，根據(jù)Haas病理分級(jí)分為IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組，電鏡下觀察自噬體并計(jì)數(shù)，觀察時(shí)需要與其他細(xì)胞器相鑒別，如調(diào)亡小體，表現(xiàn)為由胞膜包繞的細(xì)胞碎片，包有胞質(zhì)成分及核碎片，胞質(zhì)中的細(xì)胞器出現(xiàn)變性改變，可被周圍的細(xì)胞吞噬，比較IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組自噬體數(shù)量與對(duì)照組的改變，分析自噬體數(shù)量變化與病理分期的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgAN1組不同性別兩組患者在血肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白定量方面比較，差異明顯(P<0.05)，且男性患者血肌酐更高；IgAN1組HassⅠ級(jí)組患者尿蛋白定量及24 h尿蛋白定量較IgAN1組HassⅤ級(jí)患者更高，而IgAN1組HassⅤ級(jí)組患者血肌酐更高，提示IgAN1組HassⅤ級(jí)組患者腎功能減退更明顯；IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級(jí)組患者較對(duì)照組自噬體數(shù)量下降(P<0.001), 且隨著Hass病理分級(jí)的進(jìn)展，自噬體數(shù)量隨著病理級(jí)別增加而增多(P<0.01)，提示IgAN患者足細(xì)胞自噬體數(shù)目隨病理分級(jí)的增高而增加，表明IgAN的發(fā)展過程中，足細(xì)胞自噬活性逐漸恢復(fù)，可能為組織自我清理過程增加，機(jī)體啟動(dòng)自我保護(hù)和調(diào)節(jié)機(jī)制所致，由此可見足細(xì)胞自噬可能參與了IgAN的進(jìn)程，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

IgAN是我國最常見的腎小球腎炎，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的病因之一，其臨床表現(xiàn)和進(jìn)展率取決于臨床病理表型和隨訪時(shí)間，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞自噬異常在IgAN發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，本研究結(jié)果也揭示足細(xì)胞自噬與 IgA 腎病時(shí)的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，提示自噬可能為IgA腎病治療的新靶點(diǎn)提供更多的思路。