周永升， 莫小群， 張文婷， 龍勇益， 蘇 龍， 柳富杰*

（1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西 來賓 546199；2.廣西科技師范學院 廣西現(xiàn)代蔗糖業(yè)發(fā)展研究院，廣西 來賓 546199）

根據(jù)膳食纖維在水中溶解性質(zhì)的不同可分為水溶性膳食纖維（SDF）和不溶性膳食纖維（IDF）（扈曉杰等，2011）。膳食纖維作為人體所需的第七營養(yǎng)素，其對人體有重要的生理作用。因為膳食纖維不能被小腸消化吸收，對于腸道的蠕動和吸收其他食物有著良好的促進作用，并且在食用含膳食纖維的食物后，由于其在人體胃中的逗留時間長，可以延長胃的排空時間，從而減緩對于糖類的吸收、增加飽腹感，這對于糖尿病和減肥都有良好的作用（鄭文新等，2017）。有研究表明膳食纖維在血脂的調(diào)節(jié)和改善中扮演著重要角色，在一定程度上可以預防高血壓、高血脂，減少心血管疾病的發(fā)生（譚亮等，2010；袁爾東等，2002）。此外，膳食纖維還有著抗癌作用，谷物和水果中的膳食纖維可以減少人體對致癌物質(zhì)的吸收，從而有效地預防結(jié)腸癌等（李欣等，2013）。目前，國內(nèi)對于膳食纖維的研究主要致力于食品和醫(yī)療方面（翟麗麗等，2014）。

我國是甘蔗種植和甘蔗制糖大國，在甘蔗收割時產(chǎn)生了大量的蔗梢，約占整根新鮮甘蔗的1/5，但研究開發(fā)甚少，只有少部分用作動物飼料和回田物料（李玉銘等，2018）。甘蔗葉中除了有黃酮類、酚酸類、酯類、萜類、糖類等功能性成分（何耀濤等，2016），還有大量的膳食纖維，纖維含量接近50%，是膳食纖維可靠的來源（周永升，2017）。然而蔗葉中的木質(zhì)素會影響到動物飼料的適口性，因此蔗葉一般通過氨化、青貯或微貯處理后只用作反芻動物的飼料，這導致甘蔗葉飼料化開發(fā)利用進程緩慢（周志揚等，2021；郭永清等，2021；李標等，2020）。使用纖維素酶處理蔗葉，使胞內(nèi)原生質(zhì)暴露出來，同時纖維素酶水解甘蔗也能提高還原糖生成量，提高消化率，從而改善青貯甘蔗葉的品質(zhì)（何曉妹，2015）。也有研究證明適量的蔗葉全價顆粒飼料能提高肉牛的生長性能（淡明等，2018）。目前，可以使用酶解法、化學法、物理法或微生物法處理蔗葉而提取或制備膳食纖維，再做成飼料，酶法相對其他方法所需要的試驗條件溫和，很少需要高溫、高壓等，對環(huán)境產(chǎn)生的污染小，并且得到的膳食纖維雜質(zhì)較少（林杰等，2011；鄭曉靈，2007）。本研究對蔗葉進行去除蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、木質(zhì)素后，在超聲場中使用酶法制備蔗葉膳食纖維，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面法確定蔗葉膳食纖維的最佳工藝，并對比分析蔗葉水溶性膳食纖維（SDF）、蔗葉不溶性膳食纖維（IDF）和100目蔗葉粉末的堆積密度、持水力、持油力、溶脹性等指標，為提高甘蔗葉的有效利用和膳食纖維的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料與設備 甘蔗葉是收集甘蔗尾葉與種植期間人為剝落部分的混合樣品。酶制劑：熱穩(wěn)定α-淀粉酶（酶活≥3.5 U/mg，上海穎心實驗室設備有限公司）、堿性蛋白酶（酶活≥200 U/mg，合肥博美生物科技有限責任公司）、脂肪酶（酶活≥30 U/mg，上海源葉生物有限公司）、纖維素酶（酶活≥100 U/mg，山東隆科特酶制劑有限公司）。其他試劑均為分析純。儀器設備：FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、FA2004型分析天平（上海越平科學儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）、GZX-GF101-3 BS型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、HH-S8型恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）、H1850型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1 甘蔗葉的預處理 參考林杰等（2011）的方法對甘蔗葉進行去除蛋白質(zhì)、去淀粉、脫脂處理，參考Ann等（2020）、Llanes等（2019）、李春光等（2011）的方法去除木質(zhì)素。（1）粉碎過篩：將蔗葉洗凈去除雜質(zhì)，干燥后粉碎并過40目篩。（2）去除蛋白質(zhì)、淀粉：用相對于蔗葉粉末質(zhì)量分數(shù)0.3%混合酶（蛋白酶和α-淀粉酶質(zhì)量比為1∶3）溶液浸泡蔗葉粉末，其中液料比為20∶1、溫度為65℃、酶解時間為90 min，過濾，再將酶解后的濾渣用蒸餾水洗凈。（3）脫脂：將濾渣用脂肪酶進行酶解，脂肪酶用量為0.4%、溫度為50℃、酶解時間為60 min，100℃滅酶10 min，再用蒸餾水將濾渣洗至中性，放入60℃烘箱烘干，過40目篩。（4）去除木質(zhì)素：稱取上述粉末，按液料比30∶1加入體積分數(shù)0.7%的H2O2和質(zhì)量分數(shù)4%的NaOH混合溶液，在85℃下攪拌4 h，濾渣用蒸餾水洗凈，60℃干燥后過40目篩；取堿液處理后的粉末，按液料比30∶1加入31 mL/L乙酸和9.5 g/L NaClO2混合溶液，在75℃下處理1 h，過濾后用蒸餾水洗滌至中性，60℃烘干后過100目篩，備用。

1.2.2 蔗葉膳食纖維的制備 稱取1 g經(jīng)過預處理的樣品→加入液料比20∶1的蒸餾水→用乙酸、乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4→加入一定量纖維素酶→調(diào)節(jié)一定溫度后使用500 W超聲場中酶解一定時間→100℃水浴滅酶10 min→抽濾（濾渣經(jīng)過清洗干燥后研磨過100目篩得到IDF）→濾液濃縮至約10 mL→加入約4倍體積預熱至60℃的95%的乙醇，室溫下醇沉1 h→抽濾→濾渣90℃干燥至恒重得到SDF。SDF得率代表著酶解程度的大小，因此以SDF得率為考察指標，SDF得率/%=SDF質(zhì)量/預處理樣品的質(zhì)量×100。

1.2.3 酶解條件試驗設計 按照1.2.2的制備步驟進行。考慮纖維素酶添加量（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酶解溫度（40、45、50、55、60℃）、酶解時間（10、20、30、40、50 min）3個因素和水平。固定酶解溫度50℃、酶解時間20 min，以SDF得率為指標，進行單因素試驗得到最佳纖維素酶添加量，再依次確定最佳酶解溫度和最佳酶解時間。

1.2.4 Box-Behnken響應面試驗設計及驗證試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以SDF得率為指標進行三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，試驗設計見表1。確定最佳制備工藝，并建立數(shù)學模型，分析因素間的相互作用。通過規(guī)劃求解后得到酶解條件的理論值，重復5次實驗，并進行t檢驗，檢查工藝的穩(wěn)定性、模型的準確性。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計

1.2.5 蔗葉膳食纖維的理化特性分析 參考巫永華等（2020）、李晗等（2020）和郝曉華等（2021）的方法，分別測定并比較蔗葉SDF、蔗葉IDF（酶解后的濾渣經(jīng)過清洗干燥后研磨過100目篩）和100目蔗葉粉末的堆積密度、持水力、持油力、溶脹性。

堆積密度的測定：稱取0.1000 g樣品于5 mL離心管中，記錄體積。堆積密度/（g/cm3）=樣品質(zhì)量/樣品體積。

持水力的測定：稱取0.1000 g樣品于5 mL離心管中，加入1.5 mL蒸餾水，混勻，室溫靜置24 h，4000 r/min離心20 min，棄上清液，稱重。持水力/（g/g）=（樣品濕重-樣品干重）/樣品干重。

持油力的測定：稱取0.1000 g樣品于5 mL離心管中，加入市售大豆油2 mL，振蕩搖勻，室溫下放置1.5 h，4000 r/min的條件下離心30 min，除去上清液，稱重。持油力/（g/g）=（樣品吸油后重量-樣品干重）/樣品干重。

溶脹性的測定：稱取0.2000 g樣品，使用10 mL量筒量取體積后，將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL量筒中，加入約25 mL蒸餾水，振蕩均勻，室溫靜置24 h，觀察樣品的自由膨脹體積。溶脹性/（mL/g）=（吸水后樣品體積-吸水前樣品體積）/吸水前樣品體積。

1.3數(shù)據(jù)處理 通過Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和表格制作，使用minitab 18進行標準偏差計算和多重比較分析（α=0.05），運用origin2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1酶解條件單因素結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量 由圖1可知，SDF得率先顯著上升后（P＜0.05）再趨于平緩。當酶添加量小于0.4%時，SDF得率隨著纖維素酶添加量的增加逐漸上升，在酶添加量為0.4%時得率達到最大，為4.69%；當酶添加量添加至0.5%時，得率反而有所下降。因為酶解產(chǎn)物隨著酶濃度地升高而升高，但當酶的濃度過大時，部分膳食纖維被進一步水解成低聚糖，該低聚糖不能被乙醇沉淀而降低SDF得率（巫永華等，2020；李晗等，2020）。經(jīng)過多重比較發(fā)現(xiàn)，酶添加量0.3%和0.4%無顯著差異（P＞0.05），基于低耗節(jié)能原則，確定酶添加量為0.3%。

圖1 纖維素酶添加量對SDF得率的影響

2.1.2 酶解溫度 由圖2可知，SDF得率呈先上升后下降的趨勢，并且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。溫度過低時酶的活性較低，酶解效果不好，隨著酶解溫度的升高，酶的活性升高，SDF得率也在上升，在酶解溫度達到50℃時，得率為4.64%。但當溫度超過50℃時，因為溫度過高導致酶的部分失活，同時也導致溶液的黏度變大會導致底物與酶的接觸困難，使得SDF得率下降（巫永華等，2020；李晗等，2020）。因此，確定最佳酶解溫度為50℃。

圖2 酶解溫度對SDF得率的影響

2.1.3酶解時間 由圖3可知，SDF得率隨著酶解時間的增加而上升，再趨于平緩。酶解時間的不足導致了纖維素不能充分分解，當酶解時間為20 min時，SDF得率最高為4.67%；當酶解時間超過20 min時，SDF得率有所下降。下降的原因可能是長時間在酶的水解和超聲波的空穴效應、微機械效應及熱效應的共同作用下使得膳食纖維發(fā)生降解成乙醇無法沉淀的低聚糖（巫永華等，2020；李晗等，2020）。經(jīng)過多重比較發(fā)現(xiàn)，酶解時間20 min之后無顯著差異（P＞0.05），同時基于低耗節(jié)能原則，確定酶解溫度為20 min。

圖3 酶解時間對SDF得率的影響

2.2 Box-Behnken響應面試驗及驗證試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面試驗結(jié)果與分析 在單因素試驗的基礎上，以酶添加量、酶解溫度和酶解時間為考察因素，以SDF得率為指標，設計Box-Behnken響應面試驗，試驗結(jié)果見表2。利用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，可以得到SDF得率（Y）的多項式回歸方程（自然變量）。方程為：Y=-50.905+18.828A+2.064B+0.148C-0.065AB+0.110AC-8.500×10-4BC-26.650A2-0.02056B2-3.015×10-3C2。

表2 響應面試驗結(jié)果

對回歸方程進行方差分析，結(jié)果如表3所示。其中，F(xiàn)值可用于測試每個變量對響應值的意義。F越大，則相應變量的顯著程度越高。當顯著性檢驗P<0.05時，說明其具有統(tǒng)計學意義。從表3可以得出結(jié)論，模型P＜0.0001，該模型已達極顯著水平；失擬項P=0.4423＞0.05（不顯著），決定系數(shù)R2=0.9877，說明具有較高的顯著性，而R2adj=0.9719，能夠解釋試驗97.19%的響應值變化，且預測相關系數(shù)R2Pred=0.8999，CV=1.65，說明此試驗模型與真試數(shù)據(jù)擬合程度良好，擬合度較高，可用于分析和預測蔗葉SDF的制備效果?；貧w方程系數(shù)的顯著性分析：A、B、C、A2、B2、C2對SDF得率的影響達到極顯著水平，AC對SDF得率的影響達到顯著水平。酶解條件對SDF得率影響大小順序為：C>A>B，即酶解時間>纖維素酶添加量>酶解溫度。

表3 SDF得率回歸方程的方差分析結(jié)果

圖4是根據(jù)上述回歸方程繪出的各因素交互作用對SDF得率影響的等高線圖和響應曲面圖。等高線越接近橢圓表明兩因素交互作用越強，且等高線越密集則影響效果越大；響應曲面圖呈凸面，直觀地反映了這些因素對SDF得率的影響。在所研究的區(qū)域內(nèi)均存在一個極值點，隨著各因素從小到大變化，SDF得率呈現(xiàn)先增后減（或先增后緩）的趨勢，這與單因素試驗結(jié)果相一致。其中，結(jié)合表3可知，交互項AC的P值為0.0159，表明纖維素酶添加量和酶解時間之間的交互影響達到顯著水平。

圖4 各因素交互作用對SDF得率影響的等高線及響應面圖

2.2.2優(yōu)化酶解條件及驗證結(jié)果與分析 通過對試驗數(shù)據(jù)的處理與分析，并對方程進行規(guī)劃求解，得到最佳酶解條件為：酶添加量0.3%、酶解溫度49℃、酶解時間23 min，此時模型理論結(jié)果為SDF得率4.82%。進行5次重復試驗，SDF得率分別為4.76%、4.66%、4.84%、4.74%和4.83%，SDF平均得率為4.766%，與模型預測結(jié)果接近。通過t檢驗分析（α=0.05），經(jīng)過雙尾檢驗可知重復試驗值和預測值沒有顯著差異，再經(jīng)過單尾檢驗可知重復試驗的SDF得率沒有顯著減小，表明所建回歸模型具有良好的預測效果。

2.3蔗葉膳食纖維理化特性分析結(jié)果 蔗葉SDF、蔗葉IDF和100目蔗葉粉末的堆積密度、持水力、持油力和溶脹性的測定結(jié)果見表4。這些是評價膳食纖維功能的重要指標，顆粒大小、形狀和疏水－親水相互作用都影響著這些指標（巫永華等，2020；李晗等，2020；郝曉華等，2021）。

表4 蔗葉膳食纖維及蔗葉粉末的理化特性測定結(jié)果

堆積密度反映樣品的疏松程度，堆積密度越小，其結(jié)構(gòu)越疏松，比表面積越大，表面活性的特性也越好。蔗葉SDF的堆積密度相對于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別減少了24.72%、30.93%。

持水力和溶脹性較高，起到了促進腸道蠕動、使人產(chǎn)生飽腹感、增加糞便體積和水分的作用，這易于有害物質(zhì)快速排出體外。蔗葉SDF的持水力相對于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別增加了48.21%、86.82%。蔗葉SDF的溶脹性相對于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別增加了9.89%、167.73%。這可能是因為超聲和酶解打開了纖維素分子間的部分次級鍵，使親水基團暴露，提高了水合性質(zhì)。

膳食纖維對脂肪的結(jié)合能力是評價其對脂溶性組分吸附能力的重要指標。蔗葉SDF的持油力相對于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別增加了97.10%、161.54%。這可能是超聲和酶解處理破壞了纖維原有致密結(jié)構(gòu)，使更多的親水性基團和一些非極性基團同時暴露出來，從而提高了與脂肪的結(jié)合力。

3 結(jié)論

通過響應面結(jié)果可知，蔗葉SDF最佳制備的酶解條件為纖維素酶添加量0.3%、酶解溫度49℃、酶解時間23 min，此時蔗葉SDF得率為4.82%。建立的數(shù)學模型與真實數(shù)據(jù)擬合度較高，可用于分析和預測蔗葉SDF的制備效果。在最佳工藝條件下制備的蔗葉SDF與蔗葉IDF、100目蔗葉粉末相比堆積密度、持水力、持油力和溶脹性都顯著得到了改善。研究結(jié)果為蔗葉膳食纖維的開發(fā)和其在功能食品或動物飼料中的應用提供參考依據(jù)。