葛 楠， 董 鑫， 肖開(kāi)顏， 王江木， 程 雷， 王彥珺， 蘇鳳艷*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266000）

隨著人們生活水平的提高，對(duì)畜禽食品的質(zhì)量和安全性提出了更高的要求，健康安全的食品成為人們最關(guān)心的問(wèn)題之一（苗旭等，2020）。然而在發(fā)展迅猛的飼料工業(yè)中，人工合成添加劑的濫用嚴(yán)重危害了食品安全，因此人們?cè)絹?lái)越重視飼料添加劑的安全問(wèn)題，特別是對(duì)飼料添加劑的生產(chǎn)和使用提出了更嚴(yán)格的要求（高鐸等，2021；池永寬等，2020）。

中草藥飼料添加劑以中草藥物間關(guān)系和中獸醫(yī)理論為主，以飼養(yǎng)和飼料學(xué)科理論為輔，將有助于預(yù)防疾病的中草藥添加到動(dòng)物飼糧中，以此達(dá)到替代抗生素的目的（穆柳梅等，2018）。西洋參作為我國(guó)傳統(tǒng)道地藥材，具有極其豐富的藥用價(jià)值，近年來(lái)有關(guān)西洋參根部的報(bào)道甚多，然而其莖葉的利用程度較低。宋月等（2016）研究表明，西洋參莖葉對(duì)機(jī)體有增強(qiáng)免疫力的作用，通過(guò)對(duì)西洋參莖葉的合理利用可提高我國(guó)中草藥資源產(chǎn)業(yè)循環(huán)可持續(xù)發(fā)展（胡露等，2020）。本研究以西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位作用于大腸桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型，探討西洋參莖葉體外抑制大腸桿菌增殖和抗炎活性，為后續(xù)西洋參莖葉作為中草藥飼料添加劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1藥物與試劑 試驗(yàn)用西洋參莖葉采自吉林省集安市，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院教授鑒定為五加科人參屬植物西洋參（Panax quiquefolium L.）的地上部分；CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMEM細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，美國(guó)Gibco；脂多糖（LPS），北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；Hoechst染色試劑，杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；TB GreenRPremix Ex TaqTMII，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.3主要儀器Galaxy 170S CO2恒溫培養(yǎng)箱，NEW Brunswick公司；倒置熒光顯微鏡，日本OLYMPUS；超微量快速核酸蛋白測(cè)定儀（UV-1800），日本島津；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1西洋參莖葉水提取部位的制備 取西洋參莖葉和熱水按料液比1∶35于圓底燒瓶，將圓底燒瓶置于90℃恒溫水浴鍋中，提取2 h，過(guò)濾、濃縮即得西洋參莖葉水提取部位，低溫冷凍干燥備用。

2.2西洋參莖葉醇提取部位的制備 取西洋參莖葉和60%濃度甲醇按料液比1∶40于圓底燒瓶，將圓底燒瓶置于80℃水浴鍋中，回流提取2 h，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收除盡濾液中的甲醇，制得西洋參莖葉醇提取部位，低溫冷凍干燥備用。

2.3提取物溶液的配制 將冷凍干燥得到的西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位凍干粉用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液溶解并梯度稀釋配制成濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL，將制得的溶液過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4細(xì)胞分組 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組，其中試驗(yàn)組分為西洋參莖葉水提取部位組和西洋參莖葉醇提取部位組。

2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 細(xì)胞分組同2.4，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，接種后于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底80%時(shí)，棄去原營(yíng)養(yǎng)液，試驗(yàn)組加入提取物溶液，空白組和對(duì)照組加入細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，提取物作用刺激12 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育2 h，孵育結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值（A450），計(jì)算細(xì)胞增殖率，確定西洋參莖葉提取物安全試驗(yàn)濃度。

2.6 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞分為空白組、大腸桿菌侵染組和試驗(yàn)組，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底80%時(shí)，空白組加入細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，大腸桿菌侵染組加入大腸桿菌菌液，試驗(yàn)組加入提取物溶液和大腸桿菌菌液，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行Hoechst染色，于熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

2.7西洋參莖葉對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白組、LPS組和試驗(yàn)組，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，空白組加入含10% FBS的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，試驗(yàn)組和LPS組加入提取物溶液和終濃度1 μg/mL LPS溶液，培養(yǎng)12 h，于倒置顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)。

2.8 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β和TNF-α的含量 將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，共設(shè)8個(gè)組，分別為西洋參莖葉水提取部位0.125、0.25、0.5 mg/mL低中高3個(gè)試驗(yàn)組，西洋參莖葉醇提取部位0.125、0.25、0.5 mg/mL低中高3個(gè)試驗(yàn)組，LPS陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，試驗(yàn)組每孔加入相應(yīng)濃度提取物的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加入1 μg/mL的LPS，空白對(duì)照組加入細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA檢 測(cè) 試 劑 盒 說(shuō) 明 書(shū) 測(cè) 定IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。

2.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)量 試驗(yàn)分組處理同2.8，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Green PCR試劑說(shuō)明，以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，引物序列見(jiàn)表1，引物由上海生工生物有限公司進(jìn)行引物合成。

表1 引物序列

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 如圖1所示，隨著提取物濃度的升高，細(xì)胞增殖率先升高后降低，當(dāng)西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位提取物濃度為0.25 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率最高，升高了40.96%，且較空白對(duì)照組差異顯著（P<0.05），因此選擇0.125、0.25、0.5 mg/mL三個(gè)濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同濃度西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

3.2 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 如圖2和圖3所示，空白組細(xì)胞凋亡非常少，藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)量最少，大腸桿菌組有大量藍(lán)色熒光細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，西洋參莖葉提取物組正常形態(tài)細(xì)胞數(shù)量較多，藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)量有所減少，且當(dāng)西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位濃度為0.25 mg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)量最少。

圖2 西洋參莖葉水提取部位對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況的影響

圖3 西洋參莖葉醇提取部位對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況的影響

3.3西洋參莖葉對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響如圖4和圖5所示，空白組細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)長(zhǎng)梭形細(xì)胞，LPS組的細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，偽足伸長(zhǎng)，試驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)較LPS組相比，長(zhǎng)梭形狀態(tài)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)漸趨于正常，且當(dāng)西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位濃度為0.25 mg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)趨于正常。

圖4 西洋參莖葉水提取部位對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5 西洋參莖葉醇提取部位對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響

3.4 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β和TNF-α的含量 如表2所示，與空白組和試驗(yàn)組相比，LPS組的細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞炎癥因子濃度分別升高了1077.87%、699.36%、881.68%，且差異顯著（P<0.05）。與LPS組相比，當(dāng)西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位提取物濃度為0.25 mg/mL時(shí)，細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞炎癥因子濃度分別降低了50.20%、22.21%、43.41%；西洋參莖葉醇提取部位提取物濃度為0.25 mg/mL，細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞炎癥因子濃度分別降低了59.70%、30.24%、52.38%，且有顯著差異（P<0.05）。

表2 西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α的影響（n=3）

3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)量 如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞其炎癥因子基因的表達(dá)量升高了250.11%，且差異顯著（P<0.05），與LPS組相比，試驗(yàn)組的細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)量降低，當(dāng)西洋參莖葉水提取部位濃度為0.25 mg/mL時(shí)，TNF-α、IL-6和IL-1β基因表達(dá)量分別降低了12.31%、27.07%、29.01%；西洋參莖葉醇提取部位濃度為0.25 mg/mL時(shí)，TNF-α、IL-6和IL-1β基因表達(dá)量分別降低了21.54%、29.84%、31.79%，且有顯著差異（P<0.05）。

圖6 西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位對(duì)細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)的影響

4 討論

近年來(lái)，人們對(duì)食品安全性的要求越來(lái)越高，但養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用不僅導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，而且會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)在食用動(dòng)物源性食品時(shí)存在致畸、致癌、致突變隱患（姚爽，2021）。研究表明，中草藥飼料添加劑可提高動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能且不易產(chǎn)生有害殘留，具有抗菌活性（孫曉磊，2021），可提高畜禽免疫力和生產(chǎn)性能，提高動(dòng)物源性食品的安全質(zhì)量（蘇美等，2021）。中草藥飼料添加劑的開(kāi)發(fā)與利用在豬、鴿、反芻動(dòng)物等動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中越來(lái)越廣泛，趙炳凱等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，中草藥飼料添加劑可以增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力，抑制病毒從而增強(qiáng)免 疫 力；趙 鳳 至（2014）、孔 娜（2015）等 研 究 發(fā)現(xiàn)，肉雞飼糧中添加中草藥成分可以增強(qiáng)肉雞、乳鴿的機(jī)體免疫功能；喬玉霞（2016）研究發(fā)現(xiàn)，中草藥飼料添加劑可以提高仔豬抗病毒能力，調(diào)節(jié)菌群平衡；Gao（2013）等研究發(fā)現(xiàn)，中草藥飼料添加劑可明顯提高奶牛生產(chǎn)性能。

西洋參莖葉是西洋參的地上資源，具有綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值（李偉等，2021）。汪亞菁等（2016）研究證實(shí)，西洋參莖葉中皂苷和多糖含量是根中的兩倍，楊修仕等（2014）研究表明，西洋參多糖具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性；趙云利等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，西洋參皂甙能提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，張明（2010）、徐菁菁（2015）等試驗(yàn)證實(shí)，西洋參皂苷和多糖對(duì)大腸桿菌均具有一定的抑制作用。本試驗(yàn)用CCK-8法亦證實(shí)西洋參莖葉水提部位和醇提部位均可增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的增殖能力，本試驗(yàn)采用Hoechst染色法觀(guān)察大腸桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，證實(shí)西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位對(duì)大腸桿菌均有一定的抑制效果，與前人研究結(jié)論一致。本試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)西洋參莖葉水提取部位和醇提取部位均可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放，并顯著降低IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA基因表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)西洋參莖葉的水提取部位和醇提取部位均具有一定的抑菌和抗炎活性，為西洋參莖葉作為中藥飼料添加劑的利用與開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。