黃 偉，王 寧，劉峰娟，宋 博，秦新政，羅 義，魯志遠(yuǎn)，馬昊翔，張麗娟,*，王 瑋,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

庫(kù)爾勒香梨作為新疆地區(qū)貯藏量最大的水果，并且其產(chǎn)業(yè)化水平遙居新疆所有水果之首，是新疆尤其是南疆地區(qū)果農(nóng)的主要經(jīng)濟(jì)支柱[1]。香梨果實(shí)在運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中發(fā)生多種病害，尤其是由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病，嚴(yán)重影響香梨的食用品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值，給果農(nóng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，是香梨產(chǎn)業(yè)亟待解決的問(wèn)題。目前對(duì)香梨采后保鮮的方法有低溫冷藏[3]、氣調(diào)貯藏[4]、短波紫外線照射[5]等物理方法，1-甲基環(huán)丙烯熏蒸[6]、水楊酸[7]等化學(xué)方法，然而物理方法對(duì)設(shè)備有一定要求，化學(xué)合成藥物的使用在食品安全性方面存在極大的隱患。因此，尋找能持續(xù)防控此病害和其他果實(shí)采后同類病害的新途徑具有重要意義。

使用有益微生物及其代謝產(chǎn)物作為合理而安全的果實(shí)采后病害防治措施是極具前景的方法[8-9]。其中拮抗真菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)（volatile organic compounds，VOCs）在果實(shí)采后病害防治方面的重要應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)之一[10]，Contarino等[11]發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）能產(chǎn)生乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯和乙酸異戊酯等揮發(fā)性物質(zhì)，顯著抑制葡萄灰霉病。巴西麝香霉（Muscodor brasiliensissp.）LGMF1256菌株在離體條件下能完全抑制指狀青霉（Penicillium digitatum）的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)防治甜橙綠霉病的效果高達(dá)77%[12]。研究表明部分真菌能夠產(chǎn)生具有香味的抑菌揮發(fā)性物質(zhì)，甘薯長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis fimbriata）可以產(chǎn)生果香味揮發(fā)性有機(jī)物，其對(duì)桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）等11種病原真菌的生長(zhǎng)抑制率為50%～80%[13]。木霉產(chǎn)生的具有椰子香氣的6-戊基-2H-吡喃-2-酮也具有抗真菌活性，單獨(dú)施用2 mmol/L的6-戊基-2H-吡喃-2-酮能夠增強(qiáng)擬南芥對(duì)灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和蕓薹生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的抗性[14]。

目前對(duì)拮抗微生物非揮發(fā)性物質(zhì)（主要為發(fā)酵液）防治香梨采后病害研究較多，穆香軼等[15]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Y2菌株的發(fā)酵液對(duì)庫(kù)爾勒香梨黑頭?。ㄓ墒|薹生鏈格孢菌引起）的病斑直徑抑制率達(dá)到了37.66%。乳酸菌LAB86菌株發(fā)酵液處理能夠顯著降低香梨超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率及過(guò)氧化氫含量，起到延長(zhǎng)貯藏時(shí)間的作用[16]。然而，鮮有利用拮抗微生物揮發(fā)性物質(zhì)防治香梨采后病害的內(nèi)容及數(shù)據(jù)。

本研究通過(guò)測(cè)定產(chǎn)香真菌M6-5揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物病原真菌的抑菌活性，篩選M6-5菌株抑制香梨黑斑病菌鏈格孢菌的最佳生長(zhǎng)時(shí)期，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）檢測(cè)其揮發(fā)性物質(zhì)，并通過(guò)純品確定其有效抑菌成分，測(cè)試體內(nèi)條件下M6-5菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨果實(shí)采后黑斑病的抑制效果，為后續(xù)控制鏈格孢菌引起的果實(shí)采后病害提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株M6-5為實(shí)驗(yàn)室于2020年11月從廣州韶關(guān)農(nóng)田土壤中分離所得，香梨黑斑病菌鏈格孢菌由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所分離保存。庫(kù)爾勒香梨采自新疆巴音郭楞蒙古自治州庫(kù)爾勒市和什力克鄉(xiāng)。

6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯、苯乙醇、瓊脂糖、10×TEA緩沖液 上海源葉生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、Promega膠回收試劑盒 默克化工技術(shù)（上海）有限公司；TaqDNA聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、高擴(kuò)增-高特異性DNA聚合酶、去離子水 北京康為試劑生物科技有限公司；玻璃紙 北京賽珂瑪生物科技有限公司；甲醇（分析純） 天津市鑫鉑特化工有限公司；無(wú)水硫酸鈉天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-052型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-500型高壓滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司；FA-2204型電子天平 上海衡平儀器儀表廠；Rotina 380R型高速冷凍離心機(jī) 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SW-CJ-2FD型無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；B-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琦有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；TQ8040NX三重四極桿型GC-MS儀 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株M6-5形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定

將待觀察的菌株M6-5接種到PDA培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)7 d，待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板觀察菌落特征記錄并拍照保存。此外，使用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子的特征，記錄拍照存檔。

通過(guò)對(duì)ITS和tef1序列進(jìn)行進(jìn)化分子鑒定。收集在30 ℃培養(yǎng)7 d的M6-5接種，利用真菌DNA提取試劑盒提取其菌絲體DNA。以此為模板進(jìn)行序列擴(kuò)增。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）以引物對(duì)ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴(kuò)增ITS序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：10×TaqDNA聚合酶緩沖液5 μL；脫氧核糖核苷三磷酸2 μL；上下游引物各1 μL；TaqDNA聚合酶1.2 μL；模板DNA 3.6 μL；去離子水補(bǔ)足至50 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性0 s，52.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存[17]。使用PCR以引物對(duì)tef1-EF1（5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3'）和tef1-EF2（5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3'）擴(kuò)增tef1序列。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：模板DNA 1 μL；高擴(kuò)增-高特異性DNA聚合酶12.5 μL；上下游引物各1 μL；去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存[18]。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳條件：將10×TAE緩沖液稀釋至0.5×TAE作為電泳液，調(diào)整電壓為100 V，當(dāng)條帶移動(dòng)到距膠板邊沿1 cm時(shí)（約35 min），停止電泳。使用Promega膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上作比對(duì)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），下載獲得同屬菌株的ITS和tef1序列，使用MEGA中鄰接法分別構(gòu)建ITS和tef1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.2 M6-5揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的體外抑菌活性測(cè)定

采用平板對(duì)扣法，使用無(wú)菌打孔器取已培養(yǎng)7 d的鏈格孢菌餅（直徑0.8 cm），接種于PDA培養(yǎng)基正中央。去除培養(yǎng)皿蓋，中間放置直徑10 cm的滅菌玻璃紙，將其與含鏈格孢菌餅的培養(yǎng)皿對(duì)扣在一起，用兩層封口膜密封。將已培養(yǎng)7 d的菌株M6-5菌餅（直徑0.8 cm）接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為0 d，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至第5、10、15、20、25天時(shí)，取出后分別與含鏈格孢菌餅的培養(yǎng)皿對(duì)扣。對(duì)照組為培養(yǎng)至相同時(shí)間點(diǎn)的未接種M6-5的PDA培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。每組3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)結(jié)束后觀察記錄結(jié)果，按式（1）計(jì)算抑制率：

1.3.3 菌株M6-5揮發(fā)性物質(zhì)組成成分的測(cè)定

1.3.3.1 菌株M6-5揮發(fā)性物質(zhì)的提取

將菌株M6-5接種于PDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)基置于純甲醇中（1∶1，g/mL）超聲提取30 min，重復(fù)提取2～3次，合并提取液。使用布氏漏斗抽濾，除去菌體、收集濾液。旋轉(zhuǎn)濃縮至初始體積的1/3，置于三角瓶中，加入無(wú)水硫酸鈉（每10 mL濃縮液中添加1 g無(wú)水硫酸鈉），4 ℃過(guò)夜。再次過(guò)濾，收集濾液。

1.3.3.2 頂空固相微萃取

參考Sun Dongdi等[19]的方法，并有所改動(dòng)。稱取20 g濾液樣品，放入100 mL帶有硅膠墊帽的頂空萃取瓶中，置于60 ℃水浴中預(yù)平衡15 min后，推出老化過(guò)的萃取頭，頂空吸附40 min。取出萃取針頭后進(jìn)樣，250 ℃解吸5 min。

1.3.3.3 GC-MS/MS分析

參考Lamanaka等[20]的方法，并有所改動(dòng)。GC條件：InertCap WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至240 ℃，保持4 min。MS條件：電子電離源；載氣為氦氣；離子源溫度230 ℃；數(shù)據(jù)采集方式Q3掃描；掃描范圍m/z45～500。

將分析所得的質(zhì)譜圖和NIST-17譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)檢索，確定匹配度高于80%的組分[21]。采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，進(jìn)行定量分析[22]。

1.3.4 菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)純品對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的體外抑菌活性測(cè)定

用無(wú)菌打孔器取已培養(yǎng)7 d的鏈格孢菌餅（直徑0.8 cm），接種于PDA培養(yǎng)基正中央。在另一個(gè)培養(yǎng)皿中加入一個(gè)已滅菌的2 mL離心管蓋，用移液槍分別移取3.125、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μL液體主要揮發(fā)性物質(zhì)純品（6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯、苯乙醇）至離心管蓋中。培養(yǎng)皿體積為80 mL，扣除PDA培養(yǎng)基占用體積20 mL，對(duì)扣后培養(yǎng)皿的體積為140 mL，對(duì)應(yīng)揮發(fā)物純品含量分別為22.32、44.64、89.28、178.57、357.14、714.28 μL/L。對(duì)照組中離心管蓋不添加揮發(fā)物純品。去除培養(yǎng)皿蓋后，迅速對(duì)扣好，用兩層封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣。置于30 ℃培養(yǎng)10 d后，采用十字交叉法測(cè)量處理組和空白對(duì)照組菌落直徑。每組3個(gè)重復(fù)，按式（1）計(jì)算抑制率。

1.3.5 菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的體內(nèi)抑菌活性測(cè)定

挑選成熟度一致（八成熟）、大小均一、無(wú)病蟲害的庫(kù)爾勒香梨，使用3%過(guò)氧化氫溶液對(duì)香梨表面進(jìn)行消毒，晾干備用。干燥器隔板下方放置兩個(gè)生長(zhǎng)至5 d的菌株M6-5培養(yǎng)皿，去除皿蓋后用玻璃紙封住表面，以排除菌株M6-5孢子和菌絲的影響。對(duì)照組為生長(zhǎng)至5 d的PDA培養(yǎng)皿。采用打孔器在香梨果實(shí)赤道部位打一個(gè)直徑0.8 cm、深度0.5 cm的孔；同時(shí)將生長(zhǎng)7 d的鏈格孢菌打孔，取菌餅朝外放置于香梨預(yù)先打孔位置，然后放在干燥器（直徑300 mm）隔板上方，7 d后觀察并測(cè)定果實(shí)的病斑直徑。每個(gè)處理組30個(gè)果實(shí)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20軟件的Duncan多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），Excel繪制圖表，MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株M6-5形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定

菌株M6-5在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，3 d即可長(zhǎng)滿全皿。初期在培養(yǎng)基表面形成白色致密的菌絲，生長(zhǎng)7 d后，菌落表面逐漸產(chǎn)生白色點(diǎn)狀物，呈絨毛狀（圖1A），帶有明顯的椰子香氣，背面為明顯的黃色。由圖1B～D可知，分生孢子梗大小為10.1～22.3 μm×2.2～4.3 μm，多為2個(gè)一組，由菌絲不規(guī)則伸出，分枝簡(jiǎn)單，互生呈樹枝狀排列，其基部縊縮，中間膨大，頂部變細(xì)；分生孢子為卵圓形，大小為3.5～5.9 μm×3.0～4.0 μm；厚垣孢子為圓形或橢圓形，大小為7.0～12.1 μm×5.2～12.2 μm。

圖1 菌株M6-5形態(tài)特征菌落圖（A）、顯微鏡下分生孢子形態(tài)圖（B）、厚垣孢子形態(tài)圖（C）和分生孢子梗形態(tài)圖（D）Fig. 1 Morphological characteristics of colonies (A), microscopic conidium morphology (B), chlamydospore morphology (C) and conidium stem morphology (D) of strain M6-5

菌株M6-5的ITS序列長(zhǎng)度為609 bp，將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MZ930280.1。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與Trichoderma erinaceum（NR_111837.1）和T. erinaceum（DQ083009.1）序列相似性最大，達(dá)99.33%。選取同源性較高的序列構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），菌株M6-5與T. erinaceum（NR_111837.1）和T. erinaceum（DQ083009.1）親緣關(guān)系最近，歸屬于猬木霉（T. erinaceum）。菌株M6-5的tef1序列長(zhǎng)度為912 bp，將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為OK324541。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與T. erinaceum（AY750880.1）序列相似性最大達(dá)99.27%。選取同源性較高的序列構(gòu)建tef1系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），菌株M6-5與T. erinaceum（AY750880.1）親緣關(guān)系最近，支持度bootstrap值達(dá)100%，歸屬于猬木霉。菌株M6-5的ITS序列與tef1序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，均為猬木霉。

綜上所述，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)結(jié)果可以確定菌株M6-5為猬木霉。

圖2 基于ITS序列的M6-5菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain M6-5 based on ITS sequence analysis

圖3 基于tef1序列的M6-5菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain M6-5 based on tef1 sequence analysis

2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌株M6-5揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的體外抑菌活性分析

由圖4可知，隨著生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)，菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌的抑菌活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。培養(yǎng)第5天時(shí)，菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)（82.48±1.17）%，顯著高于其他生長(zhǎng)時(shí)期（P＜0.05）；培養(yǎng)5 d后，菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌的抑制率逐漸減弱，培養(yǎng)5～10 d，菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌的抑菌率維持在較高水平；而培養(yǎng)第25天時(shí)，菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌已無(wú)抑制效果（圖5），由此可以得出菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)鏈格孢菌的抑菌作用持續(xù)時(shí)間為20 d。綜上，生長(zhǎng)5 d的菌株M6-5揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的體外抑菌活性最強(qiáng)，應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

圖4 不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌株M6-5對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的抑制率Fig. 4 Inhibition percentage of M6-5 at different growth stages on A. alternata

圖5 不同生長(zhǎng)時(shí)期的M6-5對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的抑制效果Fig. 5 Inhibitory effect of M6-5 at different growth stages on A. alternata

2.3 菌株M6-5揮發(fā)性物質(zhì)組成成分分析

如表1所示，檢測(cè)到菌株M6-5共產(chǎn)生了65種揮發(fā)性物質(zhì)，其中主要組分為6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯、苯乙醇、2-烯丙基呋喃、棕櫚酸甲酯等，分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的40.12%、6.49%、4.38%、4.13%和3.48%。

表1 菌株M6-5揮發(fā)性物質(zhì)組成成分的GC-MS/MS鑒定Table 1 GC-MS/MS identification of volatile components from strain M6-5

續(xù)表1

2.4 菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)純品對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的體外抑菌活性分析

通過(guò)平板對(duì)扣檢測(cè)不同含量的3種主要揮發(fā)性物質(zhì)純品（6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯和苯乙醇）對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的抑制率。由表2可知，6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯、苯乙醇均對(duì)鏈格孢菌具有一定抑制作用，且表現(xiàn)出濃度依賴效應(yīng)，即隨著揮發(fā)性物質(zhì)純品含量的升高，抑制率也呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯、苯乙醇含量為714.28 μL/L時(shí)，抑制率分別為（21.27±0.60）%、（41.43±2.36）%、（50.23±1.07）%。由圖6可知，使用714.28 μL/L的3-羥基丁酸乙酯與苯乙醇組合處理后，抑制率為（69.38±2.42）%。

表2 不同含量揮發(fā)性物質(zhì)純品對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的抑制率Table 2 Inhibition percentages of volatile substances purified from a culture of M6-5 at different concentrations on A. alternata %

圖6 714.28 μL/L 3-羥基丁酸乙酯與苯乙醇對(duì)香梨黑斑病菌鏈格孢菌的抑制效果Fig. 6 Inhibitory effect of 714.28 μL/L ethyl 3-hydroxybutyrate and phenylethanol on A. alternata

2.5 菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病菌的體內(nèi)抑菌效果分析

如圖7所示，熏蒸7 d后，通過(guò)測(cè)量得到處理組果實(shí)的病斑直徑為（1.45±0.06）cm，對(duì)照組的病斑直徑為（2.53±0.08）cm，處理組較對(duì)照組的病斑直徑降低了（42.46±4.44）%，說(shuō)明體內(nèi)條件下，菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病具有一定的抑制效果。

圖7 菌株M6-5產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香梨黑斑病的體內(nèi)抑制效果Fig. 7 Inhibitory effect of volatile substances produced by strain M6-5 on black spot of Korla fragrant pear

3 討論與結(jié)論

木霉是一類資源豐富且在植物病害生物防治中應(yīng)用較為廣泛的生防真菌[23]，對(duì)木霉的準(zhǔn)確鑒定是對(duì)其進(jìn)行資源利用及開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，絕大部分菌株都能通過(guò)ITS序列確定種類，而對(duì)于具有相同ITS等位片段的木霉菌株，需要通過(guò)tef1序列才能區(qū)分出來(lái)，對(duì)于極少數(shù)菌株，還需要借助rpb2序列的分析[24-25]。本研究中使用ITS（ITS1和ITS4）序列及tef1序列鑒定，并分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明均歸屬于猬木霉，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與文獻(xiàn)中的比對(duì)[26-28]，將菌株M6-5鑒定為猬木霉。

微生物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，揮發(fā)性物質(zhì)的成分和含量等因?yàn)榕囵B(yǎng)基種類（如碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等）及培養(yǎng)條件（如溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間等）的不同而變化[29-30]，其抑菌效果也會(huì)受到影響[31-32]。經(jīng)不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌株M6-5熏蒸后，鏈格孢菌的受抑制效果呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱，最后無(wú)抑制作用，其中生長(zhǎng)至5 d的M6-5平板對(duì)扣后對(duì)鏈格孢菌的抑制率達(dá)到最高，推測(cè)其在生長(zhǎng)第5天含有高效抑菌成分。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鏈霉菌TD-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉病菌的抑制作用呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)至第8天時(shí)，鏈霉菌TD-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰霉病菌抑菌作用最強(qiáng)，而后抑菌率逐漸減弱[33]，與本研究結(jié)果一致。說(shuō)明拮抗微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果會(huì)隨著生長(zhǎng)時(shí)間逐漸減弱，需要選擇最佳產(chǎn)抑菌揮發(fā)性物質(zhì)的時(shí)間。

菌株M6-5對(duì)鏈格孢菌的抑菌作用持續(xù)期為20 d，目前文獻(xiàn)中對(duì)拮抗微生物產(chǎn)抑菌揮發(fā)性物質(zhì)持續(xù)期的研究甚少。產(chǎn)香真菌GS-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)釋放量在第12天達(dá)到最大[34]，將接種灰霉菌的番茄果實(shí)置于該菌培養(yǎng)至第14天的容器中，結(jié)果表明熏蒸3 d后防效為53.62%[35]。本研究中將培養(yǎng)至第5天的猬木霉M6-5用于庫(kù)爾勒香梨黑斑病的防治，與對(duì)照組相比，處理組顯著降低了果實(shí)的病斑直徑。已有研究表明木霉的揮發(fā)性物質(zhì)在果實(shí)采后病害防治中取得了良好的效果，刺孢木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠防治甜瓜果實(shí)采后鐮刀菌病害[36]，經(jīng)熏蒸處理后，較對(duì)照組的病斑直徑降低了0.5 cm。

6-戊基-2H-吡喃-2-酮是木霉中研究最為廣泛的抑菌揮發(fā)性物質(zhì)[37]，具有“椰子香氣”，這也是菌株M6-5的產(chǎn)香特征，雖然6-戊基-2H-吡喃-2-酮在M6-5中揮發(fā)性物質(zhì)總量占比最大，對(duì)鏈格孢菌的抑菌效果卻不是最好的，當(dāng)含量為714.28 μL/L時(shí)抑制率顯著低于3-羥基丁酸乙酯和苯乙醇。說(shuō)明就鏈格孢菌而言，揮發(fā)性物質(zhì)的含量與其抑制效果并不一定呈正比。有類似研究結(jié)果顯示，2-壬醇在解淀粉芽孢桿菌XJ5的揮發(fā)性物質(zhì)中峰面積占比僅0.77%，但對(duì)蘋果褐腐病菌（Monilinia fructigena）的半最大效應(yīng)濃度值卻最小，為3.43 μg/mL[38]。

3-羥基丁酸乙酯是本研究中首次發(fā)現(xiàn)的具有抑制作用的揮發(fā)性物質(zhì)，尚未查詢到關(guān)于3-羥基丁酸乙酯抑菌的文獻(xiàn)，且3-羥基丁酸乙酯與苯乙醇聯(lián)合處理優(yōu)于單獨(dú)使用對(duì)鏈格孢菌的抑菌效果。表明3-羥基丁酸乙酯存在與其他揮發(fā)性物質(zhì)組合產(chǎn)生協(xié)同增效抑菌作用的潛力。研究表明苯乙醇對(duì)果實(shí)采后病原菌具有較好的抑菌效果，方靜凡[39]使用4%苯乙醇溶液處理柑橘可以延緩其青霉病的發(fā)生時(shí)間。苯乙醇也能與其他抑菌劑組合使用[40]。

本研究?jī)H對(duì)購(gòu)買到的6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯和苯乙醇3種揮發(fā)性物質(zhì)純品開(kāi)展了對(duì)鏈格孢菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，而沒(méi)有將含量超過(guò)1%的其他揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，可能還存在對(duì)鏈格孢菌具有較好抑制作用的揮發(fā)性物質(zhì)，下一步需要考慮相關(guān)實(shí)驗(yàn)。6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯和苯乙醇均為食品用香料，能安全用于果實(shí)采后貯藏保鮮，因此后續(xù)將開(kāi)展它們?cè)隗w外對(duì)鏈格孢菌的抑制機(jī)理研究，包括對(duì)菌絲和孢子的影響，對(duì)菌絲體細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的影響，以及對(duì)果實(shí)病害的抑制效果，這將為揮發(fā)性物質(zhì)在果實(shí)采后病害防治提供一定理論依據(jù)。

綜上所述，猬木霉M6-5在培養(yǎng)至第5天時(shí)可產(chǎn)生主要抑菌揮發(fā)性物質(zhì)——6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯和苯乙醇，當(dāng)這些物質(zhì)含量為714.28 μL/L時(shí)，可顯著抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng)。6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基丁酸乙酯和苯乙醇作為食品用香料，能安全用于庫(kù)爾勒香梨果實(shí)采后貯藏保鮮。