于雯，鄭亮，王宏宇，高鑫譽，吳志軍1，，曹宏偉1，，張華1，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心）

2019年12 月以來，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染所引起的新型冠狀病毒肺炎已經(jīng)成為近世紀(jì)以來最嚴(yán)重的全球大流行傳染病，在將近兩個月的時間里，疫情迅速蔓延至全球200多個國家和地區(qū)，對人們的生命安全和全球的經(jīng)濟(jì)造成了巨大的影響[1]。新冠病毒所引起的癥狀以發(fā)熱、肺部炎癥、干咳、呼吸困難等為主要臨床表現(xiàn)，具有高傳染性，潛伏期較長，但死亡率相對較低的特點[2-3]。

新型冠狀病毒具有冠狀病毒家族的特征，屬于β冠狀病毒譜系，基因組與SARS-CoV具有79.5%的序列同一性[4-5]。SARS-CoV-2的基因組長約為29.7 kb，在5’和3’端有一個非翻譯區(qū)（UTR）。SARSCoV-2基因組編碼刺突蛋白（Spike，S）、包膜蛋白（Envelope，E）、膜蛋白（Membrane，M）、核衣殼蛋白（Nu cleocapsid，N）、ORF1a、ORF1b、ORF3、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF9b。此外，SARS-CoV-2基因組編碼的一個大型開放閱讀框（ORF1a及ORF1b)被木瓜樣蛋白酶（Nsp3)和3-C樣蛋白酶（Nsp5)進(jìn)一步分裂成16個非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1-16)。與SARS-CoV不同的是SARS-CoV-2基因組編碼完整的ORF8，但不編碼ORF8b[6-8]。

E蛋白是由SARS-CoV-2所編碼的最小的結(jié)構(gòu)蛋白，由三個結(jié)構(gòu)域組成，分別為7-12個氨基酸組成的短親水性氮末端結(jié)構(gòu)域、長約25個氨基酸的疏水跨膜區(qū)和長親水性碳末端區(qū)域[9-10]。E蛋白位于病毒的外表面，在復(fù)制過程中，E蛋白的一部分會整合到病毒顆粒包膜中，并且能夠參與病毒的組裝和出芽；E蛋白還可以作為病毒膜孔蛋白，可在宿主細(xì)胞膜上形成選擇性離子通道，介導(dǎo)特殊離子的運輸，離子通道活性對病毒復(fù)制和增殖等功能可以造成一定的影響[11]。在哺乳動物細(xì)胞中，新型冠狀病毒E蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的研究證實了E蛋白是一種單跨膜蛋白，其N端跨膜轉(zhuǎn)運，而C端暴露于細(xì)胞質(zhì)側(cè)。這可以為理解E蛋白與宿主成分的相互作用提供一個理論依據(jù)，并且為解析新型冠狀病毒的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)[12]。

該研究從NCBI網(wǎng)站上獲取SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1毒株E基因序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，合成該基因。通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得E基因，將該基因連接到真核表達(dá)載體pCMV-Myc后，轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，通過Western Blot和間接免疫熒光檢測技術(shù)檢測重組載體pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E的表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況。Western Blot結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 E重組表達(dá)蛋白大小表達(dá)正確；間接免疫熒光結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 E重組表達(dá)蛋白主要分布于HEK-293T細(xì)胞胞質(zhì)，少數(shù)分布于胞核。這些結(jié)果說明，pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，為之后研究SARS-CoV-2 E蛋白的功能以及特性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和載體

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco生物公司，含10%的胎牛血清（FBS）、100 μg·mL-1青霉素和鏈霉素；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、人胚胎腎上皮細(xì)胞（HEK-293T）、pCMV-Myc載體由實驗室保存。

1.2 試劑

LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；PCR試劑盒、一步克隆同源重組試劑盒購于諾唯贊公司；EcoR I和KpnⅠ核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；小鼠抗Myc標(biāo)簽單克隆抗體，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；引物合成和重組質(zhì)粒序列測定由擎科生物（天津）公司完成。

1.3 引物設(shè)計及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已發(fā)表在NCBI網(wǎng)站上的SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1（NC_045512）毒株基因序列報道，通過擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，并根據(jù)所得到的序列合成該基因。設(shè)計具有特異性的E基因上游引物和下游引物，上游引物：5’-TATGGCCATGGAGGCCCGAATTATGTACAGCTTCGTGAGCG-3’，下游引物：5’-CTGGATCCCCGCGGCCGCGGTACCTACA CCAGCAGGTCGGGCAC-3’，將E基因插入EcoR I和KpnⅠ位點之間，構(gòu)建pCMV-Myc-SARSCoV-2 E蛋白真核表達(dá)載體。

1.4 目的基因的獲取

利用基因合成及PCR擴(kuò)增等技術(shù)獲取目的基因，體系為20 μL：模板1 μL，Extaq聚合酶0.1 μL，Taq buffer 3.0 μL，dNTP 2 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，ddH2O 13.5 μL。PCR擴(kuò)增溫度設(shè)定的程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸20 s（30次循環(huán)）；72℃保溫10 min；反應(yīng)結(jié)束后，獲得的產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶進(jìn)行膠回收純化，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SARS-CoV-2-E真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將pCMV-Myc載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)過EcoR I和KpnⅠ切割12 h后，純化回收載體片段。將純化所得到的產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系為基因片段與載體酶切片段按照物質(zhì)的量比為3∶1的比例加入到PCR管中，用移液槍混勻，放入PCR儀中50℃保溫15 min。反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗，涂布平板，放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。次日挑取單菌落置于37℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)10 h后，使用試劑盒提取質(zhì)粒。之后進(jìn)行酶切驗證，選擇正確的質(zhì)粒測序，取10 μL質(zhì)粒進(jìn)行測序，將其命名為pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E，其余質(zhì)粒放于-20℃保存。

圖1 真核表達(dá)載體構(gòu)建路線Fig.1 Construction route of eukaryotic expression vector

1.6 間接免疫熒光法檢測

接種細(xì)胞至24孔板中，并且進(jìn)行細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞的匯和度達(dá)到60%時，用LipofectamineTM2000將800 ng的pCMV-Myc和pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞24 h。棄掉舊的培養(yǎng)液，用已滅菌的PBS洗3次，孔中加入500 μL的4%多聚甲醛溶液，靜置20 min；PBS洗3次，加入0.1% Triton X-100，靜置20 min；PBS洗3次，使用5% BSA封閉2 h；PBS洗3次，加入一抗小鼠抗Myc標(biāo)簽單克隆抗體，依據(jù)抗體說明書1∶1000稀釋，孵育2 h；PBS洗3次，再加入對應(yīng)的熒光標(biāo)記的二抗FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠，按照1∶200稀釋，避光孵育2 h；二抗孵育后，PBS洗3次，加入DAPI染液對細(xì)胞核染色15 min，使用封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 Western Blot

將細(xì)胞接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，先將板中的10% FBS的DMEM培養(yǎng)液更換為400 μL無血清DMEM培養(yǎng)液，然后將質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混合液加到相應(yīng)的孔中，轉(zhuǎn)染后4-6 h，將無血清DMEM培養(yǎng)液更換為500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中。使用已滅菌的PBS沖洗2次，每個孔中加入30 μL的RIPA裂解液，放置冰上裂解30 min。用已經(jīng)處理過的槍頭將細(xì)胞刮下放入EP管中，4℃、12000×g離心10 min，收集上清，然后加入5×Loading Buffer，100℃煮沸10 min，恢復(fù)室溫之后12000×g離心10 min，將所得的混合物經(jīng)15% SDSPAGE膠分離。電泳結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉孵育2 h后，使用1×TBST緩沖液洗膜，然后用一抗小鼠抗Myc標(biāo)簽單克隆抗體搖床孵育2 h，1×TBST緩沖液洗膜2 h，再用二抗山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記IgG，稀釋倍數(shù)1∶3000，搖床孵育2 h，1×TBST緩沖液洗膜2 h，配制曝光液，上機(jī)曝光拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 E基因的獲取

利用重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-E為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取目的基因，得到大小約為5400 bp的載體片段和228 bp的E基因片段，結(jié)果如圖2。

圖2 E基因的獲取Fig.2 Acquisition of E Gene

2.2 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E雙酶切鑒定

為了鑒定重組質(zhì)粒是否成功構(gòu)建，進(jìn)行雙酶切鑒定，加入EcoR I和KpnⅠ兩種酶，置于37℃水浴鍋中2 h，得到片段大小約為5400 bp和228 bp的兩條目的條帶，與預(yù)期結(jié)果符合，結(jié)果如圖3。測序結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 E基因成功連接至pCMV-Myc載體。

圖3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E plasmid by double enzyme digestion

2.3 E蛋白在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況

將800 ng的重組質(zhì)粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，利用間接免疫熒光技術(shù)對其分布情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E成功表達(dá)，主要分布于HEK-293T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。研究進(jìn)一步利用間接免疫熒光技術(shù)檢測pCMV-Myc、pCMV-Myc-SARSCoV-2-E質(zhì)粒與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)示蛋白的共定位情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E在細(xì)胞中表達(dá)后，SARS-CoV-2 E蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)示蛋白發(fā)生共定位情況。這些結(jié)果說明，SARS-CoV-2 E蛋白亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，其結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 間接免疫熒光技術(shù)檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)Fig.4 The expression of recombinant plasmid by IFA

圖5 SARS-CoV-2 E蛋白亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Fig.5 SARS-CoV-2 E protein can colocalize with ER

2.4 SARS-CoV-2 E蛋白的Western Blot檢測

將800 ng的重組質(zhì)粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，RIPA裂解及收集細(xì)胞。經(jīng)SDS-PAGE膠分離后，使用小鼠抗Myc單抗和山羊抗小鼠二抗檢測載體pCMV-Myc及重組表達(dá)載體pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E的表達(dá)情況，內(nèi)參（β-actin）抗體為小鼠抗β-Actin單克隆抗體。其結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的樣品中出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的條帶，對照組和空載體均未觀察到相關(guān)條帶，說明SARS-CoV-2 E蛋白在HEK-293T細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖6 Western Blot技術(shù)檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)Fig.6 The expression of recombinant plasmid by Western Blot

3 討論

SARS-CoV-2屬于巢病毒目、冠狀病毒科成員，屬于單股正鏈RNA病毒。新型冠狀病毒的爆發(fā)對全球的公共衛(wèi)生造成了威脅，也給全球的經(jīng)濟(jì)帶來了損失?，F(xiàn)有關(guān)于SARS-CoV-2的研究文獻(xiàn)較多，但是對于SARS-CoV-2 E基因的研究相對來說比較少。通過比對SARS-CoV-2和SARS-CoV的E基因序列發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與SARS-CoV的E基因同源性很高，只有4個氨基酸的差異，離子通道活性位點Asn15和Val25完全保守[13-14]；在SARS-CoV中，E蛋白缺失后，受感染細(xì)胞中應(yīng)激和凋亡標(biāo)記物表達(dá)增加，從而導(dǎo)致病毒的傳染性降低[15]；缺失E蛋白的重組病毒，會導(dǎo)致病毒滴度顯著降低以及病毒成熟發(fā)生缺陷。這些結(jié)果說明，E蛋白在病毒的成熟和出芽過程中發(fā)揮著重要的作用；此外，E蛋白還可以激活炎癥小體的形成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[16-18]；已有相關(guān)的研究表明，冠狀病毒E蛋白在膜中形成五聚體，而不是選擇性離子通道；Sarkar等[19]利用SARS-CoV核磁共振結(jié)構(gòu)作為模板模擬了SARS-CoV-2 E蛋白，通過鑒定排列在SARS-CoV-2 E蛋白內(nèi)腔側(cè)的關(guān)鍵氨基酸殘基，隨后的膜插入以及E蛋白模型的變形表明五聚體結(jié)構(gòu)能夠形成動態(tài)的封閉和開放狀態(tài)，但是跨膜區(qū)的E蛋白突變保持了PDZ結(jié)合序列（PDZbinding motif，PBM）的完整，能夠結(jié)合多個宿主蛋白，和病毒的致病性相關(guān)。

E蛋白已經(jīng)被確定在SARS-CoV-2中具有最高的抗原性，可被用于鑒定B細(xì)胞和T細(xì)胞表位。對于細(xì)胞融合來說，其抗原肽是由人類主要組織相容性復(fù)合體（MHC）提供，SARS-CoV-2 E蛋白通過離子鍵和氫鍵與MHC-I相互作用，而且比MHC-II作用次數(shù)要多。Tyr42和Tyr57在與MHC-I的相互作用中起著主導(dǎo)作用，與其他的E蛋白相比，SARS-CoV-2 E蛋白與MHCs的相互作用更強(qiáng)。因此，E蛋白能夠作為抗SARS-CoV-2的潛在疫苗靶點可以為開發(fā)新冠減毒活疫苗、滅活疫苗以及其他治療策略提供一定的理論基礎(chǔ)[20]。

通過基因合成及PCR方法擴(kuò)增出SARS-CoV-2 E基因，利用pCMV-Myc作為E基因的表達(dá)載體，成功構(gòu)建pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E重組載體，并驗證了E蛋白的成功表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況，為后續(xù)研究E基因在抗病毒反應(yīng)中的功能以及開發(fā)拮抗SARS-CoV-2藥物等奠定了一定基礎(chǔ)。