郭紹文, 鄂裘愷, 李雙雙, 葉曼娜, 汪成, 葉輝

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院病理科(上海 200011)

乳腺癌發(fā)生腋窩淋巴結(jié)(ALN)轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的最重要的指標(biāo)，腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)(ALND)在提高患者生存率的同時(shí)還可能會(huì)導(dǎo)致上肢淋巴結(jié)水腫等并發(fā)癥，準(zhǔn)確評(píng)估ALN轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)制定治療方案至關(guān)重要[1]。前哨淋巴結(jié)活檢(SLNB)是目前早期乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法和臨床觀察療效的標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，而用于術(shù)中診斷SLN轉(zhuǎn)移狀況的手段主要是冷凍切片(FS)和印片細(xì)胞學(xué)檢查(TIC)，這兩種手段雖然具有較高的敏感度和特異度，但均依賴(lài)病理醫(yī)師的主觀觀察，且結(jié)果受組織切片的選取影響大，未能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，因此探索操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確的新型診斷手段仍是臨床迫切需求[4]。一步法核酸擴(kuò)增(OSNA)是一種新型的分子診斷方法，自Tsujimoto等于2007年首次報(bào)道采用OSNA技術(shù)診斷SLN轉(zhuǎn)移情況以來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究報(bào)道普遍認(rèn)為OSNA可作為病理法的輔助方法，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感度高等特點(diǎn)[5-6]。另一方面，新輔助化療(NAC)對(duì)于局部進(jìn)展期不可手術(shù)的患者可降低腫瘤分期，使之成為可手術(shù)治療，從而提高手術(shù)的切除率，部分原本不具備保乳手術(shù)的患者還可獲得保乳手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[7]，但NAC前后行SLNB 的手術(shù)時(shí)機(jī)仍存在不同意見(jiàn)，主要是對(duì)NAC后SLNB的應(yīng)用價(jià)值存在著爭(zhēng)議[8-9]。因此，本研究擬對(duì)原發(fā)性乳腺癌患者行NAC后行SLNB，并比較OSNA 檢測(cè)與FS、TIC檢測(cè)結(jié)果的差異，旨在探討NAC對(duì)乳腺癌SLNB的影響和OSNA對(duì)檢測(cè)乳腺癌SLN轉(zhuǎn)移的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年12月至2022年2月我院收治的原發(fā)性乳腺癌患者125例作為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為原發(fā)單一病灶的女性患者，且腋窩淋巴結(jié)無(wú)腫大；(2)腫瘤T分期為 T1～T3期；(3)患者對(duì)本研究均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非浸潤(rùn)性乳腺癌；(2)術(shù)前接受過(guò)放療。

根據(jù)患者最終選取的治療方案分為NAC組(n=48)和手術(shù)組(n=77)，兩組患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、腫瘤T分期、腫瘤位置等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SC2020-S-06)。

表1 兩組患者一般資料

1.2 治療方法 NAC組采用TEC(多烯紫杉醇+表柔比星+環(huán)磷酰胺)方案或 CEF(表柔比星+環(huán)磷酰胺+5-氟尿嘧啶)方案行2～3周期輔助化療后1周內(nèi)完成手術(shù)。NAC療效判斷采用UICC實(shí)體瘤通用療效判斷標(biāo)準(zhǔn)。兩組患者均由同一組醫(yī)師完成手術(shù)，完成SLNB后行改良根治術(shù)，常規(guī)腋窩淋巴結(jié)清掃。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 前哨淋巴結(jié)(SLN)組織樣本處理 根據(jù)采集的SLN組織樣本的質(zhì)量和短軸長(zhǎng)度情況進(jìn)行切分，100 mg以下的樣本不切分，當(dāng)SLN短軸<4 mm時(shí)，切分為2塊；4 mm以上者切分為4塊。術(shù)中均行FS、TIC及OSNA 檢測(cè)，任一方法結(jié)果陽(yáng)性者，即轉(zhuǎn)行ALND[10]。術(shù)后行常規(guī)病理檢測(cè)。

1.3.2 OSNA 檢測(cè)CK19 mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄環(huán)體系進(jìn)行擴(kuò)增(RT-LAMP)，通過(guò)測(cè)定SLN組織中CK-19的含量，可以檢測(cè)出SLN中是否存在>0.2 mm的轉(zhuǎn)移病灶。采集前哨淋巴結(jié)樣本予以冷藏(2～8℃)或儲(chǔ)存在冰上(0～4℃)，不干燥，以避免RNA降解。盡快進(jìn)行處理，并將用于檢測(cè)的淋巴結(jié)的重量控制在25～600 mg之間。檢測(cè)操作主要步驟：首先將SLN組織塊進(jìn)行勻漿，使用Lynorhag裂解緩沖液(Sysmex，日本神戶)在冰(0～4℃)上裂解淋巴結(jié)；然后使用試劑盒(Lynoamp；Sysmex)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后分別將引物、CK-19、酶、CK-19陰性及陽(yáng)性質(zhì)控、淋巴結(jié)原倍及稀釋的樣本分別加入檢測(cè)系統(tǒng)(RD-100i OSNA Assay)中進(jìn)行核酸擴(kuò)增。結(jié)果判定：CK19-mRNA水平>5×103copies/μL為OSNA(++)、2.5×102～5×103copies/μL為OSNA(+)、<2.5×102copies/μL為OSNA(-)。OSNA檢測(cè)從開(kāi)始到完成只需要大約30～40 min，與常規(guī)病理檢測(cè)所需時(shí)間幾乎相同[11]。

1.3.3 常規(guī)病理檢測(cè) 病理檢測(cè)是診斷SLN轉(zhuǎn)移狀況的金標(biāo)準(zhǔn)。每塊SLN組織樣本取4張切片進(jìn)行病理染色觀察，切片厚約4～6 μm。H&E染色與OSNA檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，將采用免疫組化方法對(duì)同一淋巴結(jié)蠟塊塊進(jìn)行CK19染色并進(jìn)行分析。淋巴結(jié)塊用于組織病理學(xué)檢查，每隔200 μm制作一對(duì)系列切片(H&E染色和CK19免疫染色)。當(dāng)觀察到假陰性結(jié)果時(shí)，也需要通過(guò)CK19檢測(cè)觀察其在原癌組織中的表達(dá)[12]。

2 結(jié)果

2.1 SLNB對(duì)判斷腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值 所有患者均檢出SLN。其中NAC組共檢出83枚，平均(1.72±0.48)枚，發(fā)生ALN轉(zhuǎn)移27例(轉(zhuǎn)移率56.25%，其中4例SLN陰性)；手術(shù)組共檢出135枚，平均(1.79±0.53)枚，發(fā)生ALN轉(zhuǎn)移44例(轉(zhuǎn)移率57.14%，其中6例SLN陰性)。在兩組患者中，SLNB對(duì)判斷ALN轉(zhuǎn)移的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值以及假陰性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組SLNB 判斷腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值比較

2.2 不同檢測(cè)方法的診斷效率比較 125例患者中，常規(guī)病理檢測(cè)陽(yáng)性43例。OSNA 檢測(cè)陽(yáng)性48例(假陽(yáng)性12例)、陰性77例(假陰性7例)，F(xiàn)S檢測(cè)陽(yáng)性37例(假陽(yáng)性2例)、陰性80例(假陰性8例)，TIC檢測(cè)陽(yáng)性46例(假陽(yáng)性8例)、陰性79例(假陰性5例)。典型病例染色及OSNA定量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1～4。3種方法的敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值以及假陰性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，OSNA的特異度和準(zhǔn)確率低于FS和TIC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

注：A、B為術(shù)中SLN冰凍切片，C、D為術(shù)后SLN石蠟切片; A、C:×50倍，B、D:×200倍

注：A、B為陽(yáng)性病例，C、D為陰性病例；A、C:×200倍，B、D:×400倍

(++)、(+)、(-)表示CK19-mRNA水平分別為>5×103、2.5×102 ～ 5×103、<2.5×102 copies/μL

表3 3種不同檢測(cè)方法對(duì)SLN轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值比較

3 討論

由于ALN轉(zhuǎn)移是評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，準(zhǔn)確評(píng)估乳腺癌發(fā)生ALN轉(zhuǎn)移情況是制定治療方案的關(guān)鍵依據(jù)，而癌細(xì)胞通過(guò)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，最先在SLN出現(xiàn)癥狀，即原發(fā)腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)匯流的第一站。研究顯示，若SLN未發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，原發(fā)腫瘤區(qū)域其他淋巴結(jié)也就不會(huì)有腫瘤轉(zhuǎn)移，因而SLN的轉(zhuǎn)移情況可以作為同一淋巴匯流區(qū)域其他淋巴轉(zhuǎn)移狀況的判斷指標(biāo)[2]。而SLNB具有高檢出率、低陰性率且創(chuàng)傷較小等特點(diǎn)，在評(píng)價(jià)腫瘤臨床分期和判斷是否發(fā)生ALN轉(zhuǎn)移中具有重要應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，SLNB現(xiàn)已取代ALND成為許多早期乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)方案，SLN陰性患者可避免行ALND，從而讓患者避免遭受因ALND而引起的上肢水腫、關(guān)節(jié)功能障礙等并發(fā)癥，讓患者獲益良多。另一方面，NAC是目前治療乳腺癌的重要手段，對(duì)局部晚期患者療效確切，對(duì)臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期患者也具有良好效果，通過(guò)NAC可使腫瘤腫瘤降期從而提高了手術(shù)切除率[5]。已有諸多研究報(bào)道指出了在NAC前行SLNB對(duì)NAC方案的選擇及制定的重要價(jià)值，但考慮到因化療可能會(huì)對(duì)流入SLN的淋巴管起到破壞作用或改變淋巴的匯流途徑，因此研究者對(duì)于在NAC后行SLNB對(duì)于預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性仍存在爭(zhēng)議[13]。另一方面，術(shù)中對(duì)SLN的轉(zhuǎn)移狀況進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷，可以避免SLN陰性患者行ALND，SLN陽(yáng)性患者則可在術(shù)中同時(shí)行ALND，從而避免二次手術(shù)。因此，進(jìn)一步探討NAC是否會(huì)影響SLNB的診斷效率，為臨床選擇SLNB的時(shí)機(jī)具有重要意義。

基于此，本研究根據(jù)患者采取的治療方案，觀察比較了直接手術(shù)治療和NAC治療后患者的SLNB的診斷效率情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在納入研究的125例患者中均檢出了SLN，其中NAC組48例患者共檢出83枚，平均(1.72±0.48)枚，發(fā)生ALN轉(zhuǎn)移27例(轉(zhuǎn)移率56.25%，其中4例SLN陰性)；手術(shù)組77例患者共檢出135枚，平均(1.79±0.53)枚，發(fā)生ALN轉(zhuǎn)移44例(轉(zhuǎn)移率57.14%，其中6例SLN陰性)。在兩組患者中，SLNB對(duì)判斷ALN轉(zhuǎn)移的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值以及假陰性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說(shuō)明NAC并不會(huì)影響乳腺癌患者SLNB的結(jié)果，因而可以認(rèn)為在NAC后行SLNB同樣也能讓患者獲益，而且在NAC后通過(guò)SLNB評(píng)估患者ALN轉(zhuǎn)移狀態(tài)，患者在避免第2次手術(shù)的同時(shí)，還為更快開(kāi)始NAC治療節(jié)約了時(shí)間；還有助于了解化療對(duì)ALN的效應(yīng)情況，對(duì)ALN轉(zhuǎn)移可能還具有更好的預(yù)后評(píng)估價(jià)值[14-15]。

另一方面，快速、準(zhǔn)確評(píng)估SLN的轉(zhuǎn)移狀態(tài)是發(fā)揮術(shù)中SLNB價(jià)值的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的FS診斷SLN的敏感度和特異度較高，但假陰性率約為 10%～20%，TIC特異度高但敏感度不理想，且FS和TIC還都存在主觀性、非標(biāo)準(zhǔn)化、檢測(cè)的組織量少等缺點(diǎn)，因此探尋更為準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的診斷技術(shù)一直是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，OSNA技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)運(yùn)用分子生物學(xué)分析方法檢測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具備高精確度與客觀性[16]。通過(guò)核酸擴(kuò)增法精準(zhǔn)檢測(cè)樣本組織中腫瘤靶向細(xì)胞角蛋白19mRNA的含量來(lái)判斷腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感度高等特點(diǎn)，適合于 SLN 轉(zhuǎn)移的術(shù)中檢測(cè)[9]。OSNA通過(guò)乳腺癌SLN中的特異性分子標(biāo)志物CK19，OSNA技術(shù)可以在沒(méi)有進(jìn)行RNA純化的情況下進(jìn)行基因擴(kuò)增，并且可以用引物和DNA聚合酶的混合物在恒溫條件下孵育樣品，一步完成，耗時(shí)短，且操作較為簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高[17]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OSNA對(duì)SLNB的應(yīng)用價(jià)值，本研究以術(shù)后病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，比較了OSNA與FS和TIC三種檢測(cè)方法的診斷效率。結(jié)果顯示，雖然OSNA的特異度(85.37%)和準(zhǔn)確率(84.80%)略低于FS和TIC(特異度分別為：97.56%、90.24%，準(zhǔn)確度分別為：92.00%、90.40%)(P<0.05)，但3種方法的敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值以及假陰性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。需要注意的是，在傳統(tǒng)的FS和TIC檢測(cè)中，是將SLN標(biāo)本一切為二進(jìn)行檢測(cè)，而在本研究中為了配合ONSA檢測(cè)，統(tǒng)一將蠟塊切分為了4塊，因而使得本研究FS和TIC的敏感性顯著提高。結(jié)合本研究分析結(jié)果，可以認(rèn)為OSNA對(duì)SLNB診斷的特異度和準(zhǔn)確率是可接受的，且具有較高的靈敏度，且操作更簡(jiǎn)單、更標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果更為客觀，可以作為乳腺SLNB診斷的一種新手段進(jìn)行推廣使用。

綜上所述，本研究借鑒國(guó)內(nèi)外同類(lèi)研究的基本方法，以NAC后的患者為主要觀察對(duì)象，重點(diǎn)探討了NAC是否會(huì)影響SLNB結(jié)果，同時(shí)還分析了OSNA的診斷價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)NAC不會(huì)影響SLNB的結(jié)果，OSNA具有較高的敏感度，特異度和準(zhǔn)確率可接受。筆者認(rèn)為本研究結(jié)果對(duì)臨床在NAC前后選擇SLNB的時(shí)機(jī)具有重要參考價(jià)值，NAC后行SLNB或許可讓患者獲益更多；OSNA可作為乳腺癌SLNB術(shù)中診斷的一種新手段推廣使用。但本研究對(duì)象未能做到隨機(jī)分組，且樣本量較少，仍需要進(jìn)行更大樣本量的隨機(jī)對(duì)照研究結(jié)果以進(jìn)一步證實(shí)。

利益相關(guān)聲明：所有作者無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：郭紹文負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)和論文撰寫(xiě)；鄂裘愷、李雙雙、葉曼娜、汪成負(fù)責(zé)病歷資料、樣本及素材等收集整理、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，葉輝負(fù)責(zé)課題總體把關(guān)和論文審核。