張 曼,鞠炎錕，梅之南，熊 慧

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,湖北 武漢 430074)

1 引言

湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.) Rehder)是薔薇科蘋果屬植物[1]。該植物在我國分布廣泛且應(yīng)用歷史悠久[2]。根據(jù)《中華草本》記載, 其嫩葉作茶葉應(yīng)用已有400多年的歷史[3]。分布于華東、西南及山西、陜西、甘肅、河南、湖北、湖南、廣東等地[4]。已有眾多對湖北海棠的藥理作用進(jìn)行了廣泛的研究，現(xiàn)已經(jīng)通過實驗數(shù)據(jù)證實的藥理作用包括：降血糖、雌激素樣作用、保肝護肝、抗病原微生物[5，6]。研究表明，根皮苷及黃酮類成分是發(fā)揮藥理作用的主要藥效成分[7，8]。為進(jìn)一步研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),通過溶劑提取法、聚酰胺柱層析以及高效液相色譜等分離技術(shù)[9，10], 并通過現(xiàn)代波譜技術(shù)分析比對鑒定化合物的結(jié)構(gòu), 從70%乙醇提取物中分離與鑒定出11個化合物(圖1)，其中包含9個結(jié)構(gòu)類型多樣的黃酮類化合物，本文將介紹這些化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定的詳細(xì)過程。

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 儀器、試劑及藥材

由德國布魯克公司生產(chǎn)的核磁共振波譜儀(AVANCEIIITM, 500MHz), thermo半制備型色譜柱(250 nm×10 nm, 5 μm), 由上海貝茵科技有限公司生產(chǎn)的SHB-111A型循環(huán)水式多用真空泵, 由常州奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)的AX224ZH/E型電子天平, 由上海顧村電光科技有限公司生產(chǎn)的ZF-1型三用紫外分析儀, 由上海亞榮生化科技有限公司生產(chǎn)的RE2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 由杭州瑞析科技有限公司生產(chǎn)的Waters半制備型高效液相色譜儀, 由青島海洋化工生產(chǎn)的柱色譜硅膠(200～300目)和聚酰胺粉(100-200目), 由上海國藥集團有限公司生產(chǎn)的甲酸、甲醇、乙醇(分析純) ,來自Sigma商城的甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純, Sigma商城),由青島海洋化工生產(chǎn)的GF254型硅膠板。

湖北海棠采自湖北省宜昌市,由中南民族大學(xué)藥學(xué)院的熊慧博士鑒定為薔薇科蘋果屬(Malushupehensis(Pamp.) Rehder)的葉, 實驗剩余植物存放于中南民族大學(xué)藥學(xué)院。

3 提取與分離

干燥的湖北海棠葉稱取3 kg粉碎后用70%的乙醇室溫浸提3次, 分別浸提24 h, 12 h, 12 h, 將3次提取液抽濾，棄去濾渣,合并提取液, 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀至用密度計測量后相對密度約為1.2, 約1500 mL, 加入3倍量約4500 mL的95%乙醇進(jìn)行醇沉,室溫16 ℃靜置過夜抽濾得到上清液, 減壓濃縮至濃縮液沒有乙醇味即乙醇含量極少以便于進(jìn)行下一步萃取,約1200 mL, 用等體積的乙酸乙酯萃取3次, 將乙酸乙酯層合并減壓濃縮得到浸膏300 g, 加入1500 mL超純水, 回流至固體全部溶解, 趁熱抽濾,棄去濾渣, 邊攪拌濾液邊等待濾液自然冷卻,靜置一晚后,所有液體混勻后用10 mL的EP管分裝,再分次用3000轉(zhuǎn)離心機離心10 min后棄去上清液, 得到的沉淀用甲醇溶解, 棄去的上清液合并后再靜置一晚重復(fù)離心步驟,合并溶解液得到1000 mL液體,減壓濃縮后得到110 g固體, 上聚酰胺柱(100～200目, 0.75 kg), 用30%乙醇洗脫, 通過薄層檢測, 合并相同部分得到5個組分(Fr.A～E).Fr.B上硅膠柱, 依次用二氯甲烷-甲醇為流動相梯度洗脫(95∶5,90∶10,80∶20,0∶1), 通過薄層檢測, 合并相同部分得到4個組分(Fr.B1-B4), Fr.B1經(jīng)過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=4∶6)得到化合物11(5.3mg, tR= 20 min)、12(6mg, tR = 25 min); Fr.B2經(jīng)過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=3∶7)得到化合物1(2.19g, tR = 31 min); Fr.B3經(jīng)過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=3∶7)得到化合物2(300 mg, tR= 23 min), 3(7 mg, tR = 18 min), 4(2.8 mg, tR= 12 min),5(2.9 mg, tR= 22 min),6(6.6 mg, tR= 14 min), 7(7 mg, tR= 37.5 min); Fr.E經(jīng)過半制備高效液相色譜(流動相∶乙腈∶0.1%甲酸水=35∶65)得到化合物8(5 mg, tR= 21 min),9(17 mg, tR= 10 min)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H24O10, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH:7.06(1H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6), 6.69(2H, d, J = 8.5 Hz, H-3, 5), 6.18(1H, d, J = 2.5 Hz, H-3′), 5.96(1H, d, J = 2.0 Hz, H-5′), 5.04(1H, d, J = 7.0 Hz, H-1′′), 3.91(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.72(1H,dd,J = 12.0,4.5 Hz,H-6′′b), 2.88(2H, t, J = 8.0 Hz, H-7)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。

該波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[11]比對后,基本一致, 最終鑒定該化合物為根皮苷。

化合物2為白色粉末,硫酸-香草醛顯黃色, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H24O11, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH:6.70(1H, d,J = 2.0 Hz, H-2), 6.66(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5), 6.56(1H,dd,J = 7.0, 2.0Hz, H-6), 6.18(1H,d,J = 2.0 Hz,H-3′), 5.96(1H,d,J = 2.0 Hz,H-5′), 5.04(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.00(1H, dd, J = 12.0 Hz, 2.0Hz, H-6′′a), 3.73(1H, dd, J = 12.0Hz, 5.0 Hz, H-6′′b), 2.88(2H,m,H-7).13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。

該波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[18]比對后,基本一致,最終鑒定該化合物為3-羥基根皮苷。

化合物3為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 根據(jù)圓二色譜結(jié)果, 二氫黃酮在300～340 nm處顯示負(fù)Cotton效應(yīng), 可推定C-2的絕對構(gòu)型為S, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H22O10, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.36(1H, dd, J = 12.5, 3.0 Hz, H-2), 3.10(1H, dd, J = 16.5, 12.5 Hz, H-3a), 2.66(1H, dd, J = 16.5, 3.0 Hz, H-3b), 6.42(1H, d, J = 2.3 Hz, H-6), 6.12(1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 7.31(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 4.83(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 3.92(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.74(1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對照基本一致, 故鑒定化合物為2S-莖草素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 根據(jù)圓二色譜結(jié)果, 二氫黃酮在300～340 nm處顯示負(fù)Cotton效應(yīng)時，可推定C-2的絕對構(gòu)型為S, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H22O11, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.29(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-2), 3.05(1H, dd, J = 15.5, 12.0 Hz,H-3a), 2.66(1H, dd, J = 16.0, 2.5 Hz, H-3b), 6.42(1H, d, J= 2.3 Hz, H-6), 6.12(1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 6.91(1H, s, H-2′), 6.78(2H, m, H-5′, 6′), 4.83(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1′′), 3.92(1H, dd, J = 11.0, 1.5 Hz, H-6′′a), 3.74(1H, dd, J = 13.5, 3.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對照基本一致,故鑒定化合物為2S-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物5為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,根據(jù)圓二色譜結(jié)果, 二氫黃酮在300～340 nm處顯示正Cotton效應(yīng)時, 可推定C-2的絕對構(gòu)型為R, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H22O10, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.33(1H, dd,J = 13.5, 3.0 Hz,H-2), 3.01(1H, dd, J = 17.5, 13.0 Hz,H-3a), 2.72(1H, dd, J = 17.0, 3.0 Hz, H-3b), 6.48(1H, d, J= 2.5 Hz, H-6), 6.14(1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 7.31(2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d, J = 8.5Hz, H-3′, 5′), 4.78(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 3.94(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.76(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對照基本一致,故鑒定化合物為2R-莖草素-5-O-β-D-葡葡萄糖苷。

化合物6為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,根據(jù)圓二色譜結(jié)果, 二氫黃酮在300～340 nm顯示正Cotton效應(yīng)時, 可推定C-2的絕對構(gòu)型為R, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H22O11, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH: 5.28(1H, dd,J = 13.0, 3.0 Hz,H-2), 2.96(1H, dd, J = 17.0, 12.5 Hz, H-3a), 2.71(1H, dd, J = 17.5, 3.0 Hz, H-3b), 6.48(1H, d, J= 2.5 Hz, H-6), 6.14(1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 6.91(1H,d, J = 1.0 Hz, H-2′), 6.78(2H, m, H-5′, 6′), 4.77(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1′′), 3.95(1H, dd, J = 12.5, 2.0 Hz, H-6′′a), 3.75(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6′′b)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對照基本一致,故鑒定化合物為2R-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H20O10, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH: 6.21(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.38(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.34(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.91(1H,d, J = 8.5 Hz, H-5′), 7.32(1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6′), 5.35(1H, s, H-1′′), 0.94(3H, d, J = 6.0 Hz, H-6′′)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1。

該波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15～18]比對后,大體一致,最終鑒定此化合物為槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷。

化合物8為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H20O12, 1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δH: 6.20(1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 6.40(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 7.61(1H, d, J = 2.4 Hz, H-2′), 6.86(1H,d, J = 8.4 Hz, H-5′), 7.59(2H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz H-6′), 5.19(1H, d, J = 7.2 Hz H-1′′)。13C-NMR(CD3OD, 150 MHz)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19～21]比對后,基本一致,最終鑒定此化合物為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷化合物 9為黃色粉末,硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C21H20O11, 1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δH: 6.33(1H, s, H-5), 6.37(1H, s, H-7), 6.66(1H, s, H-10),7.49(2H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.84(1H,d, J = 8.5 Hz, H-5′), 7.21(2H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6′),5.02(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)見表1, 本文為首次報道該化合物碳譜數(shù)據(jù),并通過2D-NMR歸屬所有NMR的信號見圖2，故鑒定化合物為毛莨酢漿草苷[22，24～26]。

表1 化合物1-913C NMR數(shù)據(jù)

化合物10為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色, 由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C9H10O3,1H-NMR(CD3OD, 600 MHz)δH: 2.66(2H, t, J = 7.8 Hz, H-8), 2.80(2H, t, J = 7.8 Hz, H-7), 6.69(2H, d,J = 8.4 HzH-3, 5), 7.03(2H, d,J = 8.4 Hz, H-2, 6),該波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]比對后,大體一致, 最終鑒定此化合物為對羥基苯丙酸。

化合物11為黃色粉末, 硫酸-香草醛顯黃色,由NMR數(shù)據(jù)推出化合物的分子式為C9H6O4, 1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δH:7.91(1H, d, J = 6.0 Hz, H-2), 6.20(1H, d, J = 6.0 Hz, H-3), 6.21(1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.33(1H, d, J = 2.0 Hz, H-8),13C-NMR(CD3OD, 126 MHz)圖譜中顯示9個碳原子信號, δC:158.3(C-2), 111.8(C-3), 183.6(C-4), 163.6(C-5), 100.4(C-6), 166.4(C-7), 95.3(C-8), 160.1(C-9), 107.0(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對照基本一致, 故鑒定化合物為5,7-二羥基色原酮。

續(xù)表1

4 結(jié)語

通過對湖北海棠70%乙醇提取物的分離與純化,得到了11個化合物, 其中有9個為黃酮類化合物, 其結(jié)構(gòu)分別鑒定為根皮苷(1)、3-羥基根皮苷(2)、2S-莖草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(3)、2S-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷(4)、2R-莖草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(5)、2R-柚皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷(6)、槲皮素-3-O-β-D-鼠李糖苷(7)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(8)、毛莨酢漿草苷(9)、對羥基苯丙酸(10)、5, 7-二羥基色原酮(11), 9個黃酮類化合物,包括2個二氫查爾酮類,4個二氫黃酮醇類,2個黃酮醇類，1個橙酮類,且湖北海棠中未分離得到過橙酮類化合物,首次從湖北海棠這個植物中分離得到的化合物為化合物(7),化合物(8)和化合物(9),化合物(3)和(5)、(4)和(6)互為差向異構(gòu)體, 該研究豐富了該植物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)類型。