宋素琴，高海峰，呂 卓，3，唐琦勇，顧美英，張志東，楚 敏，朱 靜，王 瑋

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

0 引言

【研究意義】新疆喀什地區(qū)澤普縣屬大陸性暖溫帶干旱氣候，年平均氣溫11.7 ℃，年均降雨量50 mm，日照充足，土壤肥沃，無(wú)霜期長(zhǎng)適合種植馬鈴薯。馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab，簡(jiǎn)稱(chēng)PCS）是由放線菌目鏈霉菌屬的瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）引起的土傳細(xì)菌性病害[1]，當(dāng)前馬鈴薯土傳病害馬鈴薯瘡痂病影響馬鈴薯的產(chǎn)量及品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已報(bào)道瘡痂病病原菌有S.cesscabies、S.acidiscabies、S.aureofaciens等50 多種[2]。杜鵑[2]研究報(bào)道了新疆伊犁地區(qū)馬鈴薯瘡痂病，發(fā)現(xiàn)病原菌為S.acidiscabies和S.scabies，且S.acidiscabies的致病力明顯強(qiáng)于S.scabies。2002年華北地區(qū)微型薯的瘡痂病發(fā)病率達(dá)30%～60%；2010年浙江省義烏市馬鈴薯商品薯田瘡痂病發(fā)病率超過(guò)50%；2013年內(nèi)蒙古自治區(qū)11個(gè)縣（旗、市）的商品薯生產(chǎn)中均有馬鈴薯瘡痂病發(fā)生，病薯率達(dá)38%，18個(gè)種薯生產(chǎn)單位中15個(gè)有瘡痂病發(fā)生，最嚴(yán)重病薯率達(dá)100%；2012年新疆阿勒泰市區(qū)馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率超過(guò)30%，而栽培脫毒微型薯的地區(qū)瘡痂病發(fā)病較為嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)30% ～50%，嚴(yán)重達(dá)到80%以上[3-4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】馬鈴薯瘡痂病嚴(yán)重影響新疆馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)尤其是脫毒種薯生產(chǎn)造成巨大損失。近年來(lái)，新疆澤普縣瘡痂病發(fā)病較嚴(yán)重但未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。需分離鑒定馬鈴薯瘡痂病病原菌，并分析共生長(zhǎng)特性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集新疆喀什澤普縣阿依庫(kù)勒鄉(xiāng)4村的感病馬鈴薯，分離鑒定確定病原菌的種類(lèi)并研究病原菌的形態(tài)及生長(zhǎng)特性，為該病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病薯

病薯于2019年6月從新疆喀什地區(qū)澤普縣阿依庫(kù)勒鄉(xiāng)4村采集，品種為荷蘭十五，重茬連續(xù)4年種植。致病力測(cè)定所用材料均采購(gòu)于烏魯木齊某超市，馬鈴薯所用品種為費(fèi)烏瑞它。

1.1.2 土壤樣品

土壤樣品采集于新疆喀什地區(qū)澤普縣阿依庫(kù)勒鄉(xiāng)4 村馬鈴薯瘡痂病薯薯田，采集時(shí)除去發(fā)病地塊表層5 cm土壤，取5 ～15 cm耕作層土壤。

1.1.3 試劑與儀器

培養(yǎng)基：PDA，YME（麥芽浸粉10 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖4 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2），胰胨酵母浸出物培養(yǎng)基（胰蛋白胨1.0 g/L、酵母浸粉1.0 g/L、NaCl8.5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2）

儀器：培養(yǎng)皿（90 mm）、試管（15 mm×150 mm）、小刀、酒精燈、滅菌竹簽、涂布器等，均購(gòu)自新疆鼎國(guó)昌盛有限公司。

設(shè)備：HVE-50 自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250BF 生化培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SC-316 4℃立式保藏柜，海爾HAIER 公司；NEP025-1 回收試劑盒，鼎國(guó)昌盛有限公司；DL9700 PCR 儀，東林昌盛有限公司；CH20BIMF200 光學(xué)顯微鏡，日本Olympus有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化

參考方中達(dá)[5]組織分離法。

1.2.2 致病力測(cè)定

1.2.2.1 薯肉

根據(jù)柯赫氏法則采用傷口接種測(cè)定致病性，包括針刺接種法[2]和打孔接種法[6]，接種后的馬鈴薯置于室溫，30 d后觀察發(fā)病情況。

1.2.2.2 薯皮

薯塊表面用75%酒精消毒后，涂抹菌懸液，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，30 d后觀察對(duì)馬鈴薯薯皮的影響。

1.2.2.3 離體葉片

取健康馬鈴薯葉片，經(jīng)75%酒精消毒后，置于放有無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再在葉片表面滴加200μL菌株菌懸液并涂抹均勻，無(wú)菌濾紙保濕，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于室溫下15 d后觀察。

1.2.2.4 盆栽實(shí)驗(yàn)

采用灌根的方式，選取健康的馬鈴薯塊莖催芽，用無(wú)菌水沖洗干凈，在滅菌的花盆土壤中植入有芽馬鈴薯2 塊，芽尖向上，后將5 mL 菌液加入到芽尖土壤處，以等量無(wú)菌水做對(duì)照，播種前澆水1 000 mL，每組6 次重復(fù)。馬鈴薯出苗后每盆定植1 株，植株在室內(nèi)光照室12 h 時(shí)日光燈下生長(zhǎng)，每周澆1 次水并觀察，生長(zhǎng)120 d 后采收馬鈴薯塊莖。

1.2.3 生物學(xué)特性測(cè)定

參考杜鵑等[2]方法，采用結(jié)晶紫染色法，顯微鏡下觀察菌株孢子鏈和孢子的形態(tài)特征。生理生化測(cè)定指標(biāo)[6]：菌株的碳源利用、氮源利用、敏感性和對(duì)淀粉的利用等，以及溫度、pH 等對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響。

1.2.4 分子鑒定

16SrDNA 序 列 引 物 為PA（TTTGATCCTGGCTCAG）和 PH（AAGGAGGTGATCCAGCCGCA），按常規(guī)設(shè)置PCR 反應(yīng)體系，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送鼎國(guó)昌盛有限公司測(cè)序。將獲得的序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對(duì)，選取同源性較高和形態(tài)相近菌株序列進(jìn)行發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。表1

表1 常規(guī)PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增Table 1 16s rDNA sequence Amplification of conventional PCR reaction system

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

研究表明，在病薯上分離出編號(hào)為ZPCJ-1的菌株，為放線菌，在PDA 培養(yǎng)基表面凸起，產(chǎn)白色孢子，菌體絲狀分枝極細(xì)，尖端常呈螺旋狀并凸起，孢子圓筒形連接成鏈或附著在菌絲周?chē)?。圖1

圖1 菌株ZPCJ-1的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of ZPCJ-1

2.2 菌株ZPCJ-1的致病力

研究表明，接菌處理與對(duì)照基本一致，30 d后在薯皮涂抹菌液處網(wǎng)紋狀病斑加深，嚴(yán)重時(shí)有內(nèi)凹的瘡口，去皮后發(fā)現(xiàn)薯肉并無(wú)變化。

15 d后菌株在離體葉片表面滋生大量白色孢子，但葉片未出現(xiàn)腐爛。

接菌的盆栽相比于對(duì)照，收獲馬鈴薯塊莖表皮出現(xiàn)許多網(wǎng)紋狀病斑。圖2

圖2 菌株ZPCJ-1的致病性Fig.2 Determination of pathogenicity of pathogenic bacteria ZPCJ-1

2.3 菌株ZPCJ-1的生物學(xué)特性

研究表明，菌株ZPCJ-1 孢子光滑呈白色、自由彎曲狀，在胰胨酵母浸出物培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生黑色素，在PDA培養(yǎng)基產(chǎn)生可溶性色素，可利用8種單一碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇，可以利用甲硫氨酸和組氨酸為單一氮源，對(duì)鏈霉素、青霉素、苯酚、結(jié)晶紫敏感，可利用淀粉，能在pH4.0 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。表2

表2 菌株ZPCJ-1的生物學(xué)特性Table 2 Biological characteristics of ZPCJ-1

2.3.1 溫度對(duì)菌株ZPCJ-1菌落生長(zhǎng)影響

研究表明，溫度對(duì)菌株ZPCJ-1菌落生長(zhǎng)影響顯著（P＜0.05）。在25 ～30℃，菌落直徑呈上升趨勢(shì)，30 ～40℃菌落直徑呈下降趨勢(shì)，其中最適生長(zhǎng)溫度為30℃，12 d 菌落直徑達(dá)到16.17 mm。菌株ZPCJ-1在25 ～40℃均可以生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30℃。圖3

圖3 不同溫度下菌株ZPCJ-1生長(zhǎng)變化Fig.3 Effect of temperature on ZPCJ-1 growth of strain

2.3.2 光照對(duì)菌株ZPCJ-1菌落生長(zhǎng)的影響

研究表明，黑暗有利于菌株ZPCJ-1 的生長(zhǎng)，12 d 菌落直徑達(dá)到14.00 mm。全光照不利于菌株ZPCJ-1 的生長(zhǎng)，12 d 菌株的菌落直徑為6.00 mm。黑暗適宜該菌株生長(zhǎng)。圖4

圖4 不同光照下菌株ZPCJ-1生長(zhǎng)變化Fig.4 Effect of light condition on ZPCJ-1growth of strain

2.3.3 pH對(duì)菌株ZPCJ-1菌落生長(zhǎng)影響

研究表明，菌株ZPCJ-1在YME、pH為4 ～10的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。pH 為3 時(shí)菌落未生長(zhǎng)；但pH 為4 時(shí)病菌生長(zhǎng)；較佳pH 值為7，菌落直徑達(dá)16.17 mm；pH為11以及12時(shí)，菌株不生長(zhǎng)。圖5

圖5 不同pH下菌株ZPCJ-1生長(zhǎng)變化Fig.5 Effect of pH on ZPCJ-1 growth of strain

2.3.4 不同碳源與氮源對(duì)菌株ZPCJ-1 菌落生長(zhǎng)的影響

研究表明，在YME 培養(yǎng)基上，以葡萄糖作為碳源，有利于菌株的生長(zhǎng)，12 d 其菌落直徑達(dá)到15.50 mm，其依次為蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、CK、鼠李糖、肌醇，其菌落直徑依次為12.17、10.50、7.70、6.50、5.33、5.17、3.83 和3.50 mm。

以甲硫氨酸為氮源適宜菌株生長(zhǎng)，菌落直徑達(dá)到11.33 mm。圖6

圖6 不同碳氮源下菌株ZPCJ-1生長(zhǎng)變化Fig.6 Effect of carbon and nitrogen sources on ZPCJ-1 growth of strain

2.4 菌株ZPCJ-1的分子鑒定

研究表明，擴(kuò)增出約1 500 bp的16S rDNA片段。菌株ZPCJ-1與Streptomyces acidiscabiesATCC 49003（D63865）的同源性為100%，結(jié)合致病性測(cè)定結(jié)果與生物學(xué)特性確定菌株ZPCJ-1 為瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies）。圖7

圖7 用于ZPCJ-1鑒定的PCR擴(kuò)增電泳圖譜及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建Fig.7 PCR amplification electrophoresis map and construction of phylogenetic tree for identification of ZPCJ-1

3 討論

瘡痂鏈霉菌（S.acidiscabies），田間癥狀為塊莖表面出現(xiàn)近圓形至不定形木栓化瘡痂狀淡褐色病斑或斑塊，手摸質(zhì)感粗糙，呈凸起裂口狀病斑[8，9]。這類(lèi)病原菌在中國(guó)、日本、韓國(guó)均有報(bào)道[10]，我國(guó)山東[11]、黑龍江[12]、山西[13]、甘肅[14]等地均發(fā)現(xiàn)該病菌。已報(bào)道的瘡痂病病原菌還有S.scabies、S.acidiscabies、S.aureof aciens、S.europaeiscabiei等50種[2，24，25]，我國(guó)主要有S.scabies、S.turgidiscabies和S.acidiscabies3種[15]；杜鵑在我國(guó)新疆伊犁地區(qū)分離到S.acidiscabies和S.scabies，其中優(yōu)勢(shì)種為S.acidiscabies[2]。我國(guó)馬鈴薯種植區(qū)的瘡痂病病原菌同樣具有遺傳多樣性，不同產(chǎn)區(qū)病原菌種類(lèi)、數(shù)量及致病程度存在明顯差異[5，16,17]。馬鈴薯瘡痂病菌還可以侵染蘿卜、甜菜等其它作物，菌株對(duì)青霉素、苯酚、鏈霉素等均敏感，與已報(bào)道的S.acidiscabies菌株的特性一致[12]。

研究結(jié)果表明，適合菌株ZPCJ-1的適宜溫度為25 ～34℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃；黑暗更有利于菌株生長(zhǎng)；當(dāng)pH 為4 時(shí)，菌株可以生長(zhǎng)，最適pH為7；適宜生長(zhǎng)的碳源和氮源分別是葡萄糖和甲硫氨酸。不同于崔凌霄[22]、李馳[3]、陳志垚[18]等的研究結(jié)果，與菌株的種類(lèi)、生長(zhǎng)環(huán)境、地理區(qū)域等有關(guān)

我國(guó)瘡痂病病原菌種類(lèi)及其組成有明顯的多樣性特征。明確特定地區(qū)病原菌的構(gòu)成對(duì)了解及防治瘡痂病十分重要[23]。

土傳病害防治難度大，培育抗性品種是病害防治最經(jīng)濟(jì)有效的方法[24]。輪作倒茬、合理施肥，尤其降低磷肥用量，可改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，減少瘡痂等土傳病害發(fā)生，利于馬鈴薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[25，26]。

4 結(jié)論

在新疆澤普縣的感病馬鈴薯中分離鑒定馬鈴薯瘡痂病的病原菌為瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies），產(chǎn)白色光滑呈自由彎曲狀的孢子，能產(chǎn)生黑色素和可溶性色素，可利用葡萄糖等8種碳源和甲硫氨酸（Met）和組氨酸（His）2種氮源，接種健康馬鈴薯塊莖上能產(chǎn)生網(wǎng)紋狀甚至凹陷裂口狀病斑。最適生長(zhǎng)溫度為30℃，pH 為7，最適碳氮源為葡萄糖和甲硫氨酸，全黑暗利于菌株的生長(zhǎng)。