陸松松，李夢(mèng)，奴爾扎特·胡爾曼，丁慶明，徐秦竹，宋英，蘇明△

利伐沙班是一種口服抗凝藥（direct oral anticoagulants，DOACs），在血栓性疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1］。有研究顯示，利伐沙班可使凝血酶原時(shí)間（PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）明顯延長(zhǎng)［2］。即使在患者血漿中的DOACs濃度較低時(shí)仍有可能干擾凝血試驗(yàn)，導(dǎo)致臨床上對(duì)患者凝血功能的誤判。為避免血漿樣本中殘留的DOACs對(duì)凝血試驗(yàn)的影響，一般需要在最后給藥后延遲3 d或更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)才能獲得真實(shí)的凝血試驗(yàn)結(jié)果。近年研究顯示，活性炭能夠吸附檢測(cè)血漿樣本中的DOACs，從而逆轉(zhuǎn)DOACs對(duì)體外凝血試驗(yàn)檢測(cè)的影響，且活性炭自身對(duì)凝血試驗(yàn)影響較?。?］。但也有研究發(fā)現(xiàn)并非所有含有此類藥物的血漿樣本都可被活性炭完全逆轉(zhuǎn)［4］。目前國(guó)內(nèi)活性炭逆轉(zhuǎn)利伐沙班對(duì)凝血試驗(yàn)干擾的相關(guān)研究較少。本研究通過(guò)觀察活性炭對(duì)不同質(zhì)量濃度利伐沙班血漿的吸附效果，分析活性炭在凝血試驗(yàn)中排除利伐沙班影響的有效性，并就該方法在臨床應(yīng)用中的實(shí)踐價(jià)值進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及分組選取2021年5—9月于北京大學(xué)人民醫(yī)院體檢中心體檢的人群。納入標(biāo)準(zhǔn)：近3個(gè)月無(wú)抗凝及止血用藥史，無(wú)糖尿病、高血壓、腦血管疾病、心臟病、惡性血液病、實(shí)體腫瘤病史；血常規(guī)、肝腎功能檢測(cè)無(wú)異常。取臨床常規(guī)凝血項(xiàng)目檢測(cè)后的枸櫞酸鈉抗凝血樣本，每次方便抽取20例，重復(fù)24次，共納入480例，男213例，女267例，年齡22~64歲，平均（39.8±7.8）歲。所有抗凝血樣本室溫2 000 r/min離心15 min，獲得乏血小板血漿（血小板計(jì)數(shù)＜10×109/L）。將20例血漿樣本（每例0.25 mL）混合配制成正?；旌涎獫{（NPP）5 mL，取1 mL NPP為N1組；另取1 mL NPP經(jīng)活性炭處理后為N2組：10 mg醫(yī)用活性炭（400目，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）和1 mL血漿在EP管中混合5 min，2 000 r/min離心2 min后將上清液轉(zhuǎn)移到另1個(gè)EP管中再次2 000 r/min離心2 min，取上清液即活性炭處理的血漿；N3組為NPP加入利伐沙班標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO 366789-02-8，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)）使利伐沙班理論終質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400 μg/L，記為N3A組、N3B組、N3C組和N3D組，每份終體積為1 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)6次。N4組為N3組經(jīng)活性炭處理（方法同前）。所有樣本在采樣后4 h內(nèi)完成檢測(cè)。

收集同期急診科首次使用利伐沙班治療的患者22例，男15例，女7例，年齡51~82歲，平均（63.4±5.2）歲。首次服用利伐沙班前6 h采集血樣為S1組，服用利伐沙班后6 h采集血樣為S2組。所有樣本室溫2 000 r/min離心15 min，獲得乏血小板血漿。S2組經(jīng)活性炭處理后（由于樣本量有限，處理方法為5 mg活性炭處理500 μL血漿，方法同N2組）為S3組。每份患者血漿樣本量均為500 μL，所有樣本在采集后4 h內(nèi)完成檢測(cè)。本研究方案符合赫爾辛基宣言，并經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2020PHB409-01）。

1.2 液相色譜-聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測(cè)定利伐沙班質(zhì)量濃度取N3組及S2組血漿50 μL，加入甲醇（HPLC級(jí)）180 μL混合去蛋白質(zhì)，添加利伐沙班內(nèi)標(biāo)。將血漿混勻5 min，-80℃冷凍60 min保存，檢測(cè)前室溫融化后，3 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到350 μL樣本管中。使用液相色譜系統(tǒng)UltiMate 3000 RS（Dionex，Sunnyvvale，加利福尼亞）與三 重 四 極 桿6500串 聯(lián) 質(zhì) 譜 儀（AB Sciex，F(xiàn)oster City，California）進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定利伐沙班質(zhì)量濃度。

1.3 凝血試驗(yàn)及凝血因子活性檢測(cè) 使用凝血分析系統(tǒng)（型號(hào)ACL TOP 700，美國(guó)IL公司）及其配套試劑檢測(cè)N1、N2、N3、N4組PT、APTT、凝血酶時(shí)間（TT）及纖維蛋白原（FIB）水平，蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）以及凝血因子FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性，N1、N2、N3、N4、S1、S2和S3組抗Xa因子（Anti-Xa）活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用Tamhane's T2法；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Friedman檢驗(yàn)，組間多重比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活性炭和利伐沙班對(duì)凝血試驗(yàn)及凝血因子活性的影響與N1組比較，N2組PT、APTT、INR、FIB、PC、PS、AT-Ⅲ、Anti-Xa、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N3組PT、APTT延長(zhǎng)，INR、PS、AT-Ⅲ和Anti-Xa活性升高，F(xiàn)Ⅱ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性降低（P＜0.05），F(xiàn)IB水平及PC活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N4組APTT延長(zhǎng)，PS、FⅤ、FⅧ、FⅪ、FⅫ活性降低（P＜0.01），PT、INR、FIB水平，AT-Ⅲ、Anti-Xa、FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與N3組比較，N4組PT、APTT縮短，INR水平，PS、AT-Ⅲ和Anti-Xa活性明顯降低，F(xiàn)Ⅱ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性升高（P＜0.01），F(xiàn)IB水平和PC活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2 利伐沙班對(duì)患者Anti-Xa和APTT的影響與S1組比較，S2組Anti-Xa活性升高，APTT延長(zhǎng)；S3組APTT延長(zhǎng)（P＜0.01），Anti-Xa活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與S2組比較，S3組Anti-Xa活性降低，APTT縮短（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.3 利伐沙班質(zhì)量濃度對(duì)凝血試驗(yàn)及凝血因子活性的影響N3A、N3B、N3C和N3D組PT、APTT、INR、PS水平及Anti-Xa活性逐次升高，F(xiàn)Ⅴ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅪ活性逐次降低（P＜0.01）；N3C和N3D組FⅡ、FⅩ和FⅫ活性均低于N3A組，AT-Ⅲ活性高于N3A（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.4 利伐沙班質(zhì)量濃度與Anti-Xa活性相關(guān)性分析N3組利伐沙班質(zhì)量濃度與Anti-Xa活性呈正相關(guān)（rs=0.989，P＜0.01）。S2組利伐沙班質(zhì)量濃度［55.64（16.78，109.44）μg/L］與Anti-Xa活性呈正相關(guān)（rs=0.969，P＜0.01）。

3 討論

利伐沙班作為一種DOACs已廣泛應(yīng)用于臨床預(yù)防血栓，但由于目前對(duì)利伐沙班藥物濃度或活性的監(jiān)測(cè)并未普及，因此其在臨床中引發(fā)的出血事件逐漸顯現(xiàn)［5-7］。利伐沙班作為口服的活性藥，其血藥濃度的達(dá)峰值時(shí)間是4 h，但體外直接將利伐沙班溶于血漿，可立即起效。研究表明，體外血漿中的利伐沙班藥物活性在室溫可穩(wěn)定8 h［8］，其藥理機(jī)制為結(jié)合血漿中活化的FⅩ（FⅩa），使凝血酶原酶不能順利合成［9］，最終導(dǎo)致凝血酶不能被激活，從而預(yù)防血栓形成。因此，利伐沙班對(duì)采用凝固法檢測(cè)的凝血試驗(yàn)有相同的作用，可干擾試驗(yàn)中凝血酶的生成，導(dǎo)致APTT和PT延長(zhǎng)，凝血因子活性假性降低，PS活性假性升高［10-12］。本研究通過(guò)在NPP中加入利伐沙班以及對(duì)口服利伐沙班患者血漿進(jìn)行凝血試驗(yàn)，結(jié)果與既往研究基本一致。隨著利伐沙班的濃度升高，PT、APTT延長(zhǎng)，INR、PS活性及Anti-Xa活性假性升高，F(xiàn)Ⅴ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅪ活性假性減低；N3C和N3D組FⅡ、FⅩ和FⅫ活性均低于N3A組，AT-Ⅲ活性高于N3A，N3A組與N3B組AT-Ⅲ活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明AT-Ⅲ活性檢測(cè)在利伐沙班濃度發(fā)生較大變化時(shí)才會(huì)受到影響。AT-Ⅲ檢測(cè)方法為發(fā)色底物法，利伐沙班可直接結(jié)合AT-Ⅲ檢測(cè)試劑中的FⅩa，因此可能導(dǎo)致AT-Ⅲ活性假性升高。此外，本研究也證實(shí)利伐沙班對(duì)PC及FIB的檢測(cè)沒(méi)有影響，因PC檢測(cè)為采用發(fā)色底物法直接檢測(cè)血漿中PC的含量，而FIB的檢測(cè)是通過(guò)記錄試劑中凝血酶將血漿中FIB變成纖維蛋白的時(shí)間來(lái)測(cè)定FIB的活性，這2項(xiàng)檢測(cè)均無(wú)FⅩa的參與，不受利伐沙班的影響。

Tab.1 Comparison of coagulation test indexes and activity of coagulation factors between the four groups表1各組凝血試驗(yàn)指標(biāo)及凝血因子活性比較 ［n=24，M（P25，P75）］

Tab.2 Comparison of Anti-Xa level and APTT between the three groups表2 S1、S2和S3組Anti-Xa活性和APTT比較［n=22，M（P25，P75）］

活性炭表面的微孔直徑大多為2～50 nm，每克活性炭的表面積為500～1 500 m2，具有較強(qiáng)的吸附功能［13］，且其吸附能力主要針對(duì)小分子的化學(xué)物質(zhì)，而血漿中的蛋白質(zhì)由于分子質(zhì)量較大，不能通過(guò)活性炭的孔徑［14］。本研究比較NPP中加入活性炭前后的凝血指標(biāo)變化（N1組與N2組），結(jié)果顯示活性炭對(duì)凝血因子沒(méi)有吸附能力，其本身對(duì)凝血試驗(yàn)沒(méi)有影響。臨床已有活性炭膠囊用于治療藥物過(guò)量時(shí)吸附體內(nèi)藥物的案例［15-17］。國(guó)外的大多數(shù)研究為應(yīng)用基于活性炭的商品化試劑盒（DOAC-REMOVE，DOAC-STOP）在體外去除利伐沙班［3-4］，國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)成品的試劑盒可以應(yīng)用。本研究中，課題組選用常規(guī)的醫(yī)用活性炭（400目）進(jìn)行應(yīng)用研究，N4組與N1組Anti-Xa活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與N3組比較，N4組所有檢測(cè)項(xiàng)目的水平均明顯逆轉(zhuǎn)，證實(shí)活性炭具有去除利伐沙班的能力。通過(guò)S3組與S1組比較，服用利伐沙班后的血漿經(jīng)過(guò)活性炭處理，Anti-Xa活性與服藥前無(wú)差異，可見(jiàn)口服方式進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的利伐沙班同樣可被活性炭吸附。

在Anti-Xa活性檢測(cè)尚未完全普及的情況下，臨床在觀察利伐沙班活性時(shí)監(jiān)測(cè)PT會(huì)比APTT更為敏感［18］。但本研究的主要目的是觀察活性炭是否可以有效吸附血漿中的利伐沙班，由于N4組的APTT較N1組延長(zhǎng)，而2組間PT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，在首次服用利伐沙班患者樣本量有限的情況下，本研究選擇APTT進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在服用利伐沙班患者血漿經(jīng)活性炭處理后，APTT水平較服藥前6 h延長(zhǎng)，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究，如活性炭是否會(huì)吸附APTT檢測(cè)試劑中的磷脂而引起APTT變化。

Tab.3 Comparison of coagulation indexes and activity of coagulation factors between the four groups表3 N3A、N3B、N3C和N3D組凝血實(shí)驗(yàn)及凝血因子活性比較 （n=6）

在臨床工作中，筆者曾多次發(fā)現(xiàn)患者應(yīng)用利伐沙班后PT和（或）APTT明顯延長(zhǎng)，此時(shí)若進(jìn)行凝血因子活性檢測(cè)，可表現(xiàn)為多個(gè)凝血因子活性降低，易造成誤導(dǎo)，甚至影響臨床決策。若實(shí)驗(yàn)室可以明確凝血指標(biāo)異常是否由藥物引起，以及預(yù)測(cè)藥物代謝后患者凝血指標(biāo)水平變化，則可以協(xié)助臨床做出更準(zhǔn)確的處置，對(duì)臨床治療有重要的指導(dǎo)意義。再者，若延長(zhǎng)的PT和（或）APTT可通過(guò)活性炭糾正，也能避免繼續(xù)檢查PT和（或）APTT相關(guān)的凝血因子活性、狼瘡抗凝物和凝血因子抑制物，節(jié)省醫(yī)療資源。本研究中利伐沙班的最高質(zhì)量濃度為400 μg/L，實(shí)際活性炭的處理能力可能遠(yuǎn)高于此濃度。若血漿中藥物濃度較高，考慮一次活性炭處理未能完全吸附，可以重復(fù)處理的步驟，直至完全去除為止。

盡管目前的檢測(cè)系統(tǒng)中Anti-Xa活性的檢測(cè)是通過(guò)肝素來(lái)定標(biāo)，但本研究應(yīng)用此檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果可見(jiàn)Anti-Xa活性與利伐沙班質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)在N3組中為0.989，在S2組為0.969。因此，針對(duì)肝素定標(biāo)的Anti-Xa活性分析同樣可以用于檢測(cè)利伐沙班，與既往研究一致［19-20］。本研究主要探討活性炭對(duì)利伐沙班的吸附作用，而既往研究［3-4］顯示，活性炭可能會(huì)對(duì)其他口服的抗凝藥物有類似的吸附效果，如在臨床應(yīng)用中筆者曾嘗試采用活性炭去除血漿中的達(dá)比加群酯，效果同樣顯著，但缺乏大樣本的重復(fù)實(shí)驗(yàn)；然而，華法林抗凝機(jī)制為抑制維生素K依賴的FⅡ、FⅦ、FⅨ、FX的生成［21］。因此，活性炭即使可以吸附華法林，也不能改變FⅡ、FⅦ、FⅨ、FX生成減少引起的凝血指標(biāo)異常。

綜上所述，本研究證實(shí)活性炭能有效去除血漿中的利伐沙班，逆轉(zhuǎn)由利伐沙班引起的異常凝血指標(biāo)。但本研究中沒(méi)有考慮活性炭是否對(duì)凝血檢測(cè)試劑中的磷脂有吸附作用，且多數(shù)研究中，并沒(méi)有區(qū)分患者服用利伐沙班的品牌，因此對(duì)不同品牌口服利伐沙班之間是否有區(qū)別需要進(jìn)一步研究。