劉猛，姜玖良，付立躍，李俊俊，朱海濤△

膽管癌（CCA）是最常見的膽道惡性腫瘤，5年生存率低，治療方法有限［1-2］，主要包括手術(shù)、放化療、肝移植、中醫(yī)治療和靶向治療［3］。因多數(shù)CCA患者初診時(shí)已存在局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，越來越多的研究支持化療、聯(lián)合化療或靶向治療。研究發(fā)現(xiàn)，CCA患者存在表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、人表皮生長因子受體2（HER2）、絲裂原活化蛋白激酶（MEK）等多種類型突變［4］。多納非尼是一種多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑類小分子抗腫瘤藥物，可抑制多種受體激酶，包括VEGF受體、血小板衍生生長因子（PDGF）受體和Raf激酶等［5］，可用于治療肝癌［6］、甲狀腺癌［7］、結(jié)腸癌［8］等多種癌癥。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和分化等組織正常發(fā)育過程中起重要作用［9］，其異常激活與包括CCA在內(nèi)的多種類型腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)［10］。目前，多納非尼在CCA的研究較為少見。本研究旨在探究多納非尼對(duì)人CCA細(xì)胞生物學(xué)功能及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，為臨床應(yīng)用多納非尼治療CCA提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人膽管癌TFK-1細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。多納非尼（蘇州澤璟生物制藥股份有限公司）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（以色列Biological Industries公司）；DAPI、二甲基亞砜（索萊寶公司）；4%多聚甲醛、結(jié)晶紫染色液、曲拉通X-100、凋亡試劑盒（碧云天公司）；CCK-8試劑（MCE公司）；Transwell小室（美國康寧公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；Wnt、β-catenin、細(xì)胞周期蛋白-D1（Cyclin D1）、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔抗人一抗及羊抗兔二抗均購自于武漢三鷹公司；羊抗兔熒光二抗（廣州艾菲生物公司）；倒置顯微鏡（Carl Zeiss）；酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司）；流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組TFK-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，加入胰蛋白酶消化后常規(guī)傳代培養(yǎng)。以二甲基亞砜為溶劑，將多納非尼配制成2、5及10 μmol/L溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分別為2、5、10 μmol/L多納非尼組；對(duì)照組加入等量的不含多納非尼的二甲基亞砜。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率將TFK-1細(xì)胞收集在離心管中，計(jì)數(shù)后接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長后給藥干預(yù)，48 h后移去培養(yǎng)液，加入CCK-8試劑和DMEM的混合液，避光1 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況多納非尼處理細(xì)胞后，于6孔板中每孔中加入1 500個(gè)TFK-1細(xì)胞，每3 d更換1次完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d后取出。移除舊的培養(yǎng)基，PBS洗2次，用多聚甲醛室溫固定25 min，PBS洗2次，結(jié)晶紫染色液染30 min，移液器移除結(jié)晶紫，PBS洗凈，烘箱干燥，拍照記錄并用Image J軟件計(jì)算各組的克隆數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按照1.2.1將細(xì)胞分組處理，培養(yǎng)24 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，收集貼壁細(xì)胞，制成0.5 mL單細(xì)胞懸液，先后加入Annexin V和PI各5 μL，室溫下避光染色10 min。然后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長期的TFK-1細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基稀釋使其細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加進(jìn)Transwell小室上室，下室加入800 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基；1 h后用提前配制好的多納非尼替換下室培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出小室，室溫下多聚甲醛固定25 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，洗凈后用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細(xì)胞，倒置顯微鏡下拍照。侵襲實(shí)驗(yàn)：把Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例配制，加入60 μL基質(zhì)膠鋪于上室中，上下晃動(dòng)，無氣泡產(chǎn)生，4℃干燥過夜，于使用前放置于37℃中使基質(zhì)膠凝固。后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測Wnt、β-catenin、Cyclin D1及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 將TFK-1細(xì)胞按1.2.1分組處理，用RIPA裂解液冰上裂解15 min后，離心提取上清蛋白，并通過BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測量濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)樣品分離，恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后BSA封閉液室溫封閉1 h，孵育一抗GAPDH（1∶5 000）、Wnt（1∶1 000）、β-catenin（1∶5 000）、Cyclin D1（1∶5 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶5 000）于4℃過夜，PBS漂洗3遍，加入二抗（1∶5 000）常溫下孵育1 h，滴加高敏曝光液在成像系統(tǒng)中曝光，用Image J軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核的變化 將TFK-1細(xì)胞分別按照對(duì)照組和2 μmol/L多納非尼組處理，制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁后取出用4%的多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，0.2%Triton X-100通透5 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加0.5%BSA室溫封閉30 min，滴加一抗放入濕盒，4℃孵育過夜后避光孵育熒光二抗1 h，PBS浸洗玻片3次后孵育DAPI 5 min，封片后熒光顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多納非尼對(duì)TFK-1細(xì)胞增殖能力的影響2、5、10 μmol/L多納非尼組細(xì)胞增殖抑制率（%）分別為3.86±0.73、16.87±1.89和81.12±1.02，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=1 996.000，P＜0.01）。對(duì)照組及2、5、10 μmol/L多納非尼組克隆形成數(shù)（個(gè)/視野）分別為326.33±11.46、163.33±3.68、46.67±2.87和13.33±1.25，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=1 033.000，P＜0.01），見圖1。

2.2 各組TFK-1細(xì)胞凋亡水平比較對(duì)照組和2、5、10 μmol/L多納非尼組的細(xì)胞凋亡率（%）分別為3.98±0.69、6.41±0.60、13.44±1.26和20.27±2.20。隨著多納非尼濃度升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高（n=3，F(xiàn)=59.550，P＜0.05），見圖2。

2.3 多納非尼抑制TFK-1細(xì)胞遷移和侵襲隨著多納非尼濃度升高，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量逐漸減少（P＜0.05），見圖3、表1。

2.4 各組細(xì)胞β-catenin通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化隨著多納非尼濃度的升高，Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)均逐漸下降，Bax蛋白表達(dá)逐漸增高（P＜0.05），見圖4、表2。

2.5 多納非尼抑制對(duì)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核的影響與對(duì)照組［（70.67±4.92）個(gè)/視野］比較，2 μmol/L多納非尼組β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)［（24.67±3.68）個(gè)/視野］減少（n=3，t=10.930，P＜0.05），見圖5。

3 討論

肝內(nèi)CCA早期常無明顯癥狀，直至病灶進(jìn)展增大引起膽道梗阻造成膽汁淤積、引流不暢等相應(yīng)癥狀出現(xiàn)時(shí)已是晚期［11］，加之治療手段有限且療效并不理想，以致患者的存活率仍處于較低水平［12］。因此，探尋治療CCA的新型靶向藥物并研究其潛在的分子機(jī)制具有重要意義。

Fig.1 Colony formation assay results圖1各組克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig.2 The cell apoptosis in four groups of TFK-1 cells detected by flow cytometry圖2 4組TFK-1細(xì)胞凋亡流式圖

Fig.3 Effects of donafenib on migration and invasion of TFK-1 cells(crystal violet staining,×200)圖3 4組TFK-1細(xì)胞遷移和侵襲能力變化（結(jié)晶紫染色，×200）

Tab.1 Comparison of the migration and invasion of TFK-1 cells between the four groups表1各組TFK-1細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量比較（個(gè)/視野，±s）

Tab.1 Comparison of the migration and invasion of TFK-1 cells between the four groups表1各組TFK-1細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量比較（個(gè)/視野，±s）

＊＊P＜0.01，a與對(duì)照組比較，b與2 μmol/L多納非尼組比較，c與5 μmol/L多納非尼組比較，P＜0.05；表2同。

組別對(duì)照組2 μmol/L多納非尼組5 μmol/L多納非尼組10 μmol/L多納非尼組F n3 3 3 3細(xì)胞遷移167.67±5.31 77.33±4.50a 40.67±2.87ab 27.67±2.49abc 507.400＊＊細(xì)胞侵襲216.67±4.64 116.33±3.40a 33.67±2.49ab 19.33±2.62abc 1 427.000＊＊

多納非尼是一種口服抗腫瘤藥物，可阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮雙重抑制、多靶點(diǎn)阻斷的抗腫瘤作用［13］。Wnt/β-catenin通路是一個(gè)在胚胎發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，包括Wnt、卷曲蛋白（FZD）、β-catenin、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5/6、Dsh、酪蛋白激酶?（CKl）、T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）和泛素蛋白（Ub）等，β-catenin是Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)中心，胞質(zhì)中的β-catenin與TCF/LEF結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核成為轉(zhuǎn)錄激活劑，最終激活Wnt靶基因，如CMyc、CyclinD1、環(huán)氧合酶-2、c-Jun等，Wnt/β-catenin通路失調(diào)可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的各種嚴(yán)重疾?。?4］。在正常的肝臟中，Wnt/β-catenin通路大部分是無活性的，但在細(xì)胞更新、再生過程中或某些病理狀況下（如癌前病變和腫瘤）會(huì)被激活［15］。有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活在CCA的誘導(dǎo)和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，在不同類型的惡性膽道腫瘤中，存在不同Wnt配體（包括Wnt2，Wnt3，Wnt5，Wnt7和Wnt10）的上調(diào)以及β-catenin蛋白的重新分布［16］。

Fig.4 Expression changes of β-catenin pathway protein and apoptosis related protein after treatment with donafenib detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測多納非尼作用后β-catenin通路蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Tab.2 Comparison of expression levels of Wnt,β-catenin,Cyclin D1,Bax and Bcl-2 between the four groups表2各組Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Wnt,β-catenin,Cyclin D1,Bax and Bcl-2 between the four groups表2各組Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

組別對(duì)照組2 μmol/L多納非尼組5 μmol/L多納非尼組10 μmol/L多納非尼組F Wnt 0.72±0.05 0.53±0.02a 0.33±0.04ab 0.17±0.04abc 514.400＊＊β-catenin 0.69±0.03 0.46±0.03a 0.34±0.02ab 0.18±0.01abc 438.000＊＊Cyclin D1 0.80±0.04 0.63±0.03a 0.34±0.02ab 0.31±0.02abc 594.300＊＊Bax 0.15±0.03 0.27±0.02a 0.42±0.01ab 0.90±0.03abc 990.800＊＊Bcl-2 0.53±0.02 0.32±0.02a 0.23±0.02ab 0.13±0.03abc 475.000＊＊

Fig.5 Changes in β-catenin entry into the nucleus after treatment with donafenib detected by immunofluorescence assay(immunofluorescence staining,×200)圖5免疫熒光檢測多納非尼處理后β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核的變化（免疫熒光染色，×200）

維持增殖信號(hào)、激活侵襲和遷移是腫瘤的兩大生物學(xué)能力［17］。本研究表明，多納非尼在體外抑制了人膽管癌TFK-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，其在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞凋亡失調(diào)被認(rèn)為是癌癥發(fā)展的主要原因之一［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著多納非尼濃度的升高，人膽管癌TFK-1細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)逐漸升高，提示多納非尼可促進(jìn)TFK-1細(xì)胞凋亡。有研究表明藤黃酸能夠在膽管癌細(xì)胞中抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。筆者推測多納非尼可能通過影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CCA中發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究顯示，多納非尼抑制了通路蛋白Wnt、β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)，說明多納非尼能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白會(huì)結(jié)合FZD蛋白與LRP5/6蛋白組成的異源二聚體受體復(fù)合物，最終導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核［19］。本研究顯示，多納非尼能夠抑制β-catenin從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，進(jìn)一步表明多納非尼能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。

綜上所述，多納非尼可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化抑制人CCA TFK-1細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為多納非尼治療膽管癌提供一定的理論基礎(chǔ)和參考，但多納非尼影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。此外，多納非尼在CCA中的作用還需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。