繆小兵，朱興華，張邢松，沈 蓉，賈美群

卵巢上皮性癌是女性病死率最高的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，約75%的患者就診時已為晚期，晚期患者的5年生存率低于40%[1]。卵巢高級別漿液性癌(high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC)是卵巢上皮性癌中最常見的病理類型[2]。目前，腫瘤細胞減滅術聯(lián)合以鉑類為基礎的化療以及PARP抑制劑，是晚期HGSOC的標準治療模式，但多數(shù)患者仍會出現(xiàn)復發(fā)、耐藥，最終死亡[3]。近年，免疫治療的快速發(fā)展為晚期HGSOC患者帶來了新的希望。PD-1是細胞表面受體，主要位于T細胞表面。PD-1與PD-L1或PD-L2結合，可抑制T細胞的功能，促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤免疫微環(huán)境的復雜性和多樣性，可影響免疫檢查點抑制劑的療效。在多種腫瘤中，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAM)是產生免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的關鍵細胞。TAM可直接或間接調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中PD-1、PD-L1/PD-L2的表達。TAM分為M1型和M2型，M1型主要發(fā)揮抗腫瘤功能，M2型則通過產生免疫抑制因子促進腫瘤進展[5-6]。目前，PD-1、PD-L1在HGSOC中的表達及作用已有較多報道，但關于PD-L2的研究甚少。本文著重探討PD-L2在HGSOC中的表達及其臨床意義，旨在為HGSOC的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2008年1月～2019年12月我院接受初次腫瘤細胞減滅術的HGSOC石蠟標本61例?；颊吣挲g39～78歲，中位年齡55歲，患者術前均未行放、化療或其他特殊治療，術后行紫杉醇+鉑類(卡鉑或順鉑)化療。61例HGSOC中，術前血清CA125≤35 U/mL 5例，>35 U/mL 55例，1例患者術前血清CA125水平不詳。腫瘤累及單側卵巢26例，雙側卵巢35例；腫瘤最大徑<10 cm 39例，≥10 cm 22例。病理分期按照FIGO(2014)的標準：I～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期47例。手術滿意度：腫瘤細胞減滅術后無殘余病灶(R0)15例，有殘余病灶(NR0)46例。腹水量：≤500 mL 41例，>500 mL 20例。一線含鉑化療：鉑敏感(復發(fā)時間≥6個月)49例，鉑耐藥(復發(fā)時間<6個月或化療期間腫瘤進展/穩(wěn)定)12例。對所有病例進行隨訪，截至時間2021年8月16日，中位隨訪時間32個月(2～125個月)。

1.2 免疫組化標本均常規(guī)取材，經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行免疫組化EnVision法染色。兔PD-L2單克隆抗體(D7U8C，稀釋度1 ∶200)購自Cell Signaling Technology公司；小鼠CD68(Pan-巨噬細胞標志物)單克隆抗體(KP1，稀釋度1 ∶3 000)購自Abcam公司；兔CD163(M2型巨噬細胞標志物)單克隆抗體(D6U1J，稀釋度1 ∶200)購自Cell Signaling Technology公司。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，用已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判讀參考Okadome等[7]的標準，腫瘤細胞(tumor cell, TC)PD-L2根據(jù)陽性細胞染色強度和陽性細胞比例進行綜合評分。(1)按陽性細胞著色強度進行評分：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分；(2)按陽性細胞百分比進行評分：陽性細胞<10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；兩項評分相乘：≥3分為TC PD-L2陽性，<3分為TC PD-L2陰性。腫瘤浸潤性免疫細胞(tumor-infiltrating immune cell, TIIC)PD-L2按陽性細胞百分比判讀：≥5%為TIIC PD-L2陽性，<5%為TIIC PD-L2陰性[8]。選取4個高倍視野對CD68、CD163陽性染色細胞進行計數(shù)，并求其平均值。利用耶魯大學開發(fā)的X-tile軟件，計算CD68、CD163強、弱陽性的最佳截斷值(cut-off值)。據(jù)X-tile軟件計算，將陽性細胞數(shù)>78個/HPF判讀為CD68強陽性，≤78個/HPF判讀為CD68弱陽性；將陽性細胞數(shù)>80個/HPF判讀為CD163強陽性，≤80個/HPF判讀為CD163弱陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件、GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析。應用Pearson χ2、Fisher精確概率法分析TC、TIIC中PD-L2表達與HGSOC臨床病理特征的關系。采用非配對t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗比較CD68、CD163陽性細胞數(shù)在TC、TIIC PD-L2陽性、陰性組間的差異。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗。單因素和多因素預后分析，采用Cox風險比例回歸模型，將單因素分析有統(tǒng)計學意義的變量納入多因素Cox回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HGSOC中PD-L2的表達及其與臨床病理特征的關系TC以及TIIC PD-L2陽性染色定位于細胞膜/細胞質(圖1)。61例HGSOC中TC PD-L2陽性17例，陽性率27.9%；TIIC PD-L2陽性37例，陽性率60.7%。TC PD-L2表達與一線含鉑化療反應性相關，其在鉑耐藥患者中的陽性率(58.3%，7/12)高于鉑敏感患者中的陽性率(20.4%，10/49)(P=0.026)，但TC PD-L2表達與患者年齡、術前血清CA125水平、腫瘤最大徑、累及側別、病理分期、手術滿意度及腹水量均無關(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達與患者年齡、術前血清CA125水平、腫瘤最大徑、累及側別、病理分期、手術滿意度、腹水量及一線含鉑化療反應性均無關(P均>0.05，表1)。

表1 HGSOC中PD-L2表達與臨床病理特征的關系

aPearson χ2檢驗；bFisher精確概率檢驗；c1例患者術前血清CA125水平不詳

2.2 HGSOC中CD68、CD163的表達及其與PD-L2的關系CD68、CD163免疫組化陽性染色定位于細胞質(圖2、3)。本組對CD68、CD163陽性染色細胞進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，CD68在TC PD-L2陰性組中的表達高于TC PD-L2陽性組(P<0.000 1，圖4A)。與此相反，CD163在TC PD-L2陽性組中的表達高于TC PD-L2陰性組(P=0.001 1，圖4B)。CD68、CD163在TIIC PD-L2陰性組與陽性組中的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05，圖4C、D)。

①A①B②③

2.3 HGSOC中PD-L2表達與預后的關系61例獲得隨訪HGSOC患者中，死亡22例(22/61，36.1%)，進展35例(35/61，57.4%)。Kaplan-Meier生存分析顯示：TC PD-L2陽性患者的總生存期(overall survival, OS)和無進展生存期(progression-free survival, PFS)比陰性患者低(P均<0.05)，但TIIC PD-L2表達與OS和PFS均無關(P均>0.05，圖5)。因術前血清CA125 ≤35 U/mL以及鉑耐藥患者例數(shù)較少，故術前血清CA125水平、一線含鉑化療反應性不納入Cox單因素及多因素分析。Cox單因素分析顯示：TC PD-L2(P=0.039)、CD68(P=0.014)、CD163(P=0.024)表達與OS相關。TC PD-L2(P=0.007)、CD68(P=0.033)、CD163(P=0.016)表達也與PFS相關。Cox多因素分析顯示：TC PD-L2表達是影響OS和PFS的相關因素，但不是獨立的預后因素(P均>0.05，表2)。進一步分析發(fā)現(xiàn)：TC PD-L2陽性、CD68弱陽性以及TC PD-L2陽性、CD163強陽性患者的預后更差(P均<0.05，圖6)。

3 討論

免疫逃逸是TC的重要特征，由多種因素介導，包括細胞表面抑制性配體(如PD-L1)。PD-L1通過與T細胞上的PD-1受體相互作用以誘導T細胞耗竭。PD-L2是PD-1受體的第二個配體，同樣可抑制T細胞功能[9-10]。PD-L1在造血細胞(T細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞和骨髓來源的肥大細胞)、非造血細胞(血管和淋巴管內皮細胞、上皮細胞、角質形成細胞、間充質干細胞、胎盤合體滋養(yǎng)細胞)以及TC上廣泛表達。PD-L2與PD-L1不完全相同，其主要表達于造血細胞，包括樹突狀細胞、巨噬細胞、骨髓來源的肥大細胞、B細胞、Th2細胞和活化的T細胞，PD-L2也可表達于TC。盡管PD-L1和PD-L2都可作為PD-1的配體，但它們有各自獨特的其它結合伴侶。如PD-L1可與B7-1(CD80)結合，而PD-L2可與反義導向分子RGMb結合。PD-L1的結合伴侶B7-1主要由造血細胞和抗原呈遞細胞表達，而PD-L2的結合伴侶RGMb主要表達于巨噬細胞[11]。

圖4 HGSOC中PD-L2表達與CD68、CD163表達的關系：A.TC PD-L2陰性組和陽性組中CD68陽性細胞數(shù)；B.TC PD-L2陰性組和陽性組中CD163陽性細胞數(shù)；C.TIIC PD-L2陰性組和陽性組中CD68陽性細胞數(shù)；D.TIIC PD-L2陰性組和陽性組中CD163陽性細胞數(shù)

圖5 HGSOC中PD-L2表達的Kaplan-Meier生存曲線：A.TC PD-L2表達與HGSOC患者OS的關系；B.TC PD-L2表達與HGSOC患者PFS的關系；C.TIIC PD-L2表達與HGSOC患者OS的關系；D.TIIC PD-L2表達與HGSOC患者PFS的關系

圖6 HGSOC中TC PD-L2和CD68/CD163聯(lián)合檢測的Kaplan-Meier生存曲線：A.TC PD-L2與CD68不同表達組與HGSOC患者OS的關系；B.TC PD-L2與CD68不同表達組與HGSOC患者PFS的關系；C.TC PD-L2與CD163不同表達組與HGSOC患者OS的關系；D.TC PD-L2與CD163不同表達組與HGSOC患者PFS的關系

表2 Cox單因素和多因素回歸模型分析HGSOC患者OS和PFS

目前，根據(jù)PD-1/PD-L1的免疫療法在治療黑色素瘤、非小細胞肺癌、膀胱癌等晚期腫瘤中取得了令人滿意的臨床效果[9]。有研究報道，PD-1、PD-L1在卵巢上皮性癌腫瘤組織中的表達比癌旁組織高，漿液性癌尤為明顯，且PD-1、PD-L1在病理分期晚的患者中陽性率高，患者的預后較差[4]。Webb等[12]報道HGSOC中PD-L1主要表達于腫瘤相關CD68+巨噬細胞，而TC通常不表達PD-L1。PD-L1+細胞常與CD8、CD4以及PD-1+腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)、CD25+FoxP3+調節(jié)性T細胞以及其它TIL亞群共定位，且PD-L1+患者常預后良好。近期文獻報道[13]HGSOC中的PD-L1主要在巨噬細胞(而非TC)中表達，PD-1主要由淋巴細胞表達；CD3、PD-L1以及PD-1高表達患者常預后較好。目前，PD-L2在卵巢癌組織中的表達及其與患者預后關系的研究尚少。有研究報道，PD-L2在正常卵巢組織表達較低，而在卵巢癌中表達較高，在疾病進展過程中卵巢癌微環(huán)境可誘導PD-L2表達[14]。Xue等[15]報道PD-L2在卵巢癌組織中的陽性率為22.08%(17/77)。本實驗顯示，TC、TIIC中PD-L2在HGSOC中的陽性率分別為27.9%(17/61)、60.7%(37/61)。Xue等[15]的研究顯示，PD-L2的表達狀態(tài)與卵巢癌患者的臨床病理特征無關，本組TC PD-L2的表達與一線含鉑化療反應性相關，其在鉑耐藥患者中的陽性率(58.3%，7/12)高于鉑敏感患者中的陽性率(20.4%，10/49)(P=0.026)，但TC PD-L2的表達與患者年齡、術前血清CA125水平、腫瘤最大徑、累及側別、病理分期、手術滿意度及腹水量均無關(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達與患者年齡、術前血清CA125水平、腫瘤最大徑、累及側別、病理分期、手術滿意度、腹水量及一線含鉑化療反應性均無關(P均>0.05)。此外，Xue等[15]報道PD-L2高表達卵巢癌患者的OS顯著縮短，PD-L2高表達是卵巢癌患者的獨立預后因素。本實驗結果顯示TC PD-L2陽性患者的OS和PFS比陰性患者低(P均<0.05)，但TIIC PD-L2的表達與OS和PFS均無關(P均>0.05)。Cox單因素和多因素分析顯示：TC PD-L2表達是影響OS和PFS的相關因素，但不是獨立的預后因素(P均>0.05)。

研究表明，TAM常表達PD-L1和PD-L2。通常M1型巨噬細胞主要發(fā)揮抗腫瘤功能，M2型則通過產生免疫抑制因子促進腫瘤進展。有研究認為，M1型巨噬細胞的作用是同時具有抗腫瘤和促腫瘤功能：(1)M1型巨噬細胞在免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用，M1型巨噬細胞浸潤與一些腫瘤患者預后良好有關，可抑制TC增殖、誘導TC凋亡，如在肝細胞癌中，M1型巨噬細胞低浸潤、M2型巨噬細胞高浸潤與肝細胞癌患者預后不良有關。(2)M1型巨噬細胞還可促進腫瘤的進展，如在胰腺癌中M1型巨噬細胞可通過誘導TC上皮-間質轉化促進轉移[16-17]。Sumitomo等[18]報道非小細胞肺癌中M2型巨噬細胞的浸潤，與較差的DFS和OS相關。本實驗結果顯示，CD68在TC PD-L2陰性組中的表達高于TC PD-L2陽性組(P<0.000 1)；與此相反，CD163在TC PD-L2陽性組中的表達高于TC PD-L2陰性組(P=0.001 1)。CD68、CD163在TIIC PD-L2陰性組與陽性組中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。Kaplan-Meier生存曲線顯示：TC PD-L2陽性、CD68弱陽性及TC PD-L2陽性、CD163強陽性患者的預后更差(P均<0.05)。

綜上所述，HGSOC中PD-L2、CD68、CD163的表達影響患者的OS和PFS。聯(lián)合檢測PD-L2、CD68以及CD163表達可為HGSOC患者的預后判斷提供依據(jù)，同時為免疫治療提供實驗數(shù)據(jù)。