羅 帥,李 瑤,鐘戀君,鐘燕燕,王 凱,譚 娜,王進(jìn)京
乳腺癌是全球女性發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害女性健康[1]。新輔助化療是治療乳腺癌的重要手段,旨在使腫瘤降期、增加手術(shù)及保乳機(jī)會(huì),也可獲取藥物敏感性信息進(jìn)而指導(dǎo)后續(xù)治療。同時(shí),新輔助化療前后生物學(xué)標(biāo)志物可以發(fā)生改變,且與治療及預(yù)后相關(guān)[2]。本文探討新輔助化療前后腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(stromal tumor infiltrating lymphocytes, sTIL)浸潤(rùn)水平和PD-L1表達(dá)的變化,分析其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系,為新輔助化療療效評(píng)估提供參考。
1.1 材料收集2015~2019年遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科乳腺癌患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn):女性、術(shù)前穿刺活檢確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、新輔助化療4~6周期、新輔助化療后行乳腺癌改良根治術(shù)、臨床病理資料及隨訪信息;患者治療前后的存檔蠟塊及切片完整。排除標(biāo)準(zhǔn):新輔助化療后達(dá)病理完全緩解(pathologic complete response, pCR),確診時(shí)有其它原發(fā)腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病者。
1.2 方法選取具有代表性蠟塊組織[3],如穿刺標(biāo)本:浸潤(rùn)性癌成分最多且長(zhǎng)度≥5 mm,根治術(shù)后標(biāo)本:殘余腫瘤組織最多;行常規(guī)HE染色及免疫組化EnVision兩步法染色??谷薖D-L1單克隆抗體(SP142,稀釋度1 ∶100;上海羅氏公司),ER、PR、HER-2、Ki-67及EnVision試劑盒購(gòu)自福州邁新公司,具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片均由兩名病理醫(yī)師,采用雙盲法判讀。
1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)
1.3.1sTIL判讀標(biāo)準(zhǔn) 參考2014年國(guó)際腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)工作組對(duì)乳腺癌TIL評(píng)估建議[4],sTIL評(píng)分=(腫瘤間質(zhì)內(nèi)單個(gè)核炎性細(xì)胞面積/腫瘤間質(zhì)面積)×100%;而對(duì)于新輔助化療后sTIL判讀按以上標(biāo)準(zhǔn)和Dieci等[5]評(píng)估建議進(jìn)行;低倍鏡下(100×)界定HE染色切片上的浸潤(rùn)性癌區(qū)域,隨機(jī)選取區(qū)域內(nèi)7個(gè)高倍視野(400×),排除sTIL最高和最低值,計(jì)算sTIL評(píng)分的平均值。按sTIL百分比分成低sTIL浸潤(rùn)組(<10%)、中sTIL浸潤(rùn)組(10%~50%)、高sTIL浸潤(rùn)組(>50%)。
1.3.2PD-L1(SP142)判讀標(biāo)準(zhǔn) 以扁桃體組織作為陽(yáng)性對(duì)照,觀察腫瘤細(xì)胞中免疫細(xì)胞(immune cells, IC)的PD-L1染色情況,任何浸潤(rùn)性癌及周邊的腫瘤相關(guān)間質(zhì)中IC表達(dá)所占區(qū)域:≥1%定義為陽(yáng)性[6]。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法進(jìn)行兩分類變量相關(guān)性分析;無(wú)瘤生存期(disease-free surviva, DFS)定義為從新輔助化療后行手術(shù)切除到疾病復(fù)發(fā)或死亡時(shí)間,總生存期(overall surviva, OS)定義為從手術(shù)切除到死亡時(shí)間,采用Kaplan-Meier法比較各組的DFS及OS,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 臨床病理特征本組80例乳腺癌新輔助化療前粗針穿刺及配對(duì)新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本,患者均為女性,年齡29~72歲,平均47歲。組織學(xué)分級(jí)I級(jí)10例(12.5%),Ⅱ級(jí)64例(80.0%),Ⅲ級(jí)6例(7.5%)。ER陽(yáng)性54例(67.5%),PR陽(yáng)性36例(45.0%),HER-2陽(yáng)性26例(32.5%)。脈管侵犯15例(18.8%);伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例(56.3%)(表1)。
2.2 新輔助化療前后sTIL浸潤(rùn)水平變化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系新輔助化療前穿刺組織中sTIL水平:低sTIL組(67.5%)、中sTIL組(22.5%)、高sTIL組(10.0%)(圖1~3)。新輔助化療后根治術(shù)標(biāo)本中sTIL水平:低sTIL組(45.0%)、中sTIL組(28.7%)、高sTIL組(26.3%),其中有8例sTIL浸潤(rùn)等級(jí)降低,43例不變,29例升高。sTIL與患者年齡(P=0.025)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.026)有相關(guān)性;與腫瘤最大徑、組織學(xué)分級(jí)、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER-2狀態(tài)、Ki-67、脈管侵犯、分子分型及MP分級(jí)均無(wú)相關(guān)性(表1)。
2.3 新輔助化療前、后PD-L1表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌中PD-L1表達(dá)模式:乳腺癌間質(zhì)免疫細(xì)胞胞膜的完整或環(huán)狀棕黃色染色(圖4),以扁桃體組織作為陽(yáng)性對(duì)照(圖5)。新輔助化療前、后PD-L1陽(yáng)性率分別為18.8%、32.5%。新輔助化療后,10例PD-L1由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性,49例PD-L1前后不變,21例PD-L1陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性;PD-L1與患者年齡、腫瘤最大徑、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理參數(shù)均無(wú)相關(guān)性(表1)。
2.4 生存分析以患者行手術(shù)日期為隨訪起點(diǎn),對(duì)80例新輔助化療進(jìn)行隨訪,失訪5例,剩余75例患者中位隨訪時(shí)間35個(gè)月(14~77個(gè)月),3例復(fù)發(fā),6例死亡。結(jié)果顯示:sTIL不同變化組間的DFS及OS無(wú)明顯差異(P=0.686,P=0.776,圖6、7);PD-L1不同變化組間的DFS及OS也無(wú)明顯差異(P=0.575,P=0.713,圖8、9)。
新輔助化療作為乳腺癌系統(tǒng)性治療的重要組成部分,在臨床治療中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),新輔助化療宏觀上能引起腫瘤體積變化,微觀上可引起微環(huán)境中生物學(xué)標(biāo)志物的變化[7]。目前,對(duì)新輔助化療后微環(huán)境中腫瘤免疫分子標(biāo)志物變化及具體機(jī)制研究尚不清楚,尤其是PD-L1(SP142)表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)性報(bào)道較少。
①②③④⑤圖1 sTIL呈低浸潤(rùn)水平分布于乳腺癌間質(zhì)中 圖2 sTIL呈中等浸潤(rùn)水平分布于乳腺癌間質(zhì)中 圖3 sTIL呈高浸潤(rùn)水平分布于乳腺癌間質(zhì)中 圖4 PD-L1在乳腺癌間質(zhì)的IC中表達(dá),EnVision兩步法 圖5 PD-L1在扁桃體中表達(dá)(陽(yáng)性對(duì)照),EnVision兩步法
表1 新輔助化療前后sTIL、PD-L1變化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系
目前,sTIL作為乳腺癌腫瘤微環(huán)境中研究較廣泛的免疫組化標(biāo)志物,高水平sTIL與更好的新輔助化療療效及預(yù)后相關(guān),尤其是在三陰型和HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌中[8]。新輔助化療后sTIL水平可改變,本組中新輔助化療前后高sTIL浸潤(rùn)組分別為:10%、26.3%,有29例sTIL浸潤(rùn)等級(jí)升高,有8例降低,總體比例呈升高趨勢(shì),與文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示sTIL與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性,年齡較大(≥50歲)患者組新輔助化療后sTIL升高比例高于年齡較小組(<50歲),可能原因是年齡偏低組的自身免疫系統(tǒng)更穩(wěn)定,微環(huán)境的調(diào)節(jié)能力更強(qiáng),不易受新輔助化療影響而導(dǎo)致sTIL的改變。淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組新輔助化療后sTIL升高的比例明顯高于伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,可能的原因是伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組微環(huán)境中sTIL免疫反應(yīng)功能較弱,導(dǎo)致腫瘤侵襲性變強(qiáng)易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
除了sTIL外,PD-L1也是乳腺癌腫瘤微環(huán)境中重要的免疫組化標(biāo)志物,其預(yù)后價(jià)值仍存在爭(zhēng)議。Impassion 130數(shù)據(jù)表明[11],腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞PD-L1陽(yáng)性(IC>1%)的晚期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移三陰型乳腺癌患者可以在阿替利珠單抗+白蛋白紫杉醇治療中獲益;但I(xiàn)mpassion 131 Ⅲ期臨床試驗(yàn)[12]卻顯示無(wú)法獲益。目前,關(guān)于PD-L1(SP142)在乳腺癌新輔助化療的研究較少。本組新輔助化療前后PD-L1陽(yáng)性率分別為18.8%、32.5%,新輔助化療后有21例由陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性,10例由陽(yáng)性轉(zhuǎn)陰性。在新輔助化療后由陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性的21例病例中,有13例前后乳腺癌間質(zhì)中的PD-L1陽(yáng)性IC分布不均,剩余8例新輔助化療前后的IC分布基本一致;在新輔助化療后由陽(yáng)性轉(zhuǎn)陰性的10例中,有2例新輔助化療前后的PD-L1免疫細(xì)胞分布不均,新輔助化療后免疫細(xì)胞減少。本組PD-L1與患者年齡、腫瘤最大徑、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理參數(shù)及sTIL免疫組化指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性,是首次對(duì)新輔助化療前后PD-L1(SP142)相關(guān)性分析。
圖6 sTIL不同變化組與患者DFS的關(guān)系
圖7 sTIL不同變化組與患者OS的關(guān)系
圖8 PD-L1不同變化組與DFS的關(guān)系
圖9 PD-L1不同變化組與OS的關(guān)系
目前,關(guān)于新輔助化療后sTIL、PD-L1(SP142)變化的預(yù)后意義研究較少,sTIL的預(yù)后意義也存在爭(zhēng)議。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)新輔助化療后sTIL增加與預(yù)后不良相關(guān),而Miyashita等[14]的發(fā)現(xiàn)與之相反。本組中sTIL不同組間未出現(xiàn)明顯生存優(yōu)勢(shì)的差異,但從生存曲線可看出sTIL改變組的生存優(yōu)勢(shì)均優(yōu)于sTIL不變組,與Lee等[15]研究一致;PD-L1不同組間也未出現(xiàn)明顯生存優(yōu)勢(shì)的差異,但PD-L1陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性組的DFS及OS均低于PD-L1陽(yáng)性轉(zhuǎn)陰性組和不變組。由此可見(jiàn),PD-L1的表達(dá)傾向于不良預(yù)后。鑒于本實(shí)驗(yàn)樣本量有限,sTIL和PD-L1的預(yù)后意義還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確。
總之,新輔助化療后乳腺癌腫瘤免疫相關(guān)指標(biāo)sTIL和PD-L1可發(fā)生變化,客觀評(píng)價(jià)新輔助化療后腫瘤免疫相關(guān)指標(biāo)變化,對(duì)臨床預(yù)后評(píng)估及個(gè)體化治療具有積極意義。