王 翠，謝彩華，趙雪麗，王淑娟，柴 茂，馬震原，楊海波，劉 影，王東方，閆若潛

(河南省動物疫病預(yù)防控制中心 河南省重大動物疫病監(jiān)測預(yù)警及防控重點實驗室，河南 鄭州 450008)

干擾素是一類動物機體產(chǎn)生的具有多重生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。α干擾素屬于細胞水平上的廣譜的抗病毒、抗腫瘤細胞因子[1]，其主要通過抑制病毒增殖、增強抗腫瘤活性及加強NK細胞殺傷力從而發(fā)揮作用[2]，是一類具有臨床應(yīng)用價值的抗病毒制劑。重組雞α干擾素(rChIFN-α)是雞α干擾素和白細胞介素兩種基因融合表達的蛋白，具有α干擾素和白細胞介素-2的雙重生物學(xué)活性，適宜劑量rChIFN-α在雞體內(nèi)具有顯著的抗病毒活性和免疫增強活性，是有應(yīng)用潛力的基因工程抗病毒制劑[3]。

目前我國尚無rChIFN-α生物學(xué)活性測定的國家標(biāo)準(zhǔn)，《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2001版)《中國藥典》均采用細胞病變抑制法測定干擾素的生物學(xué)活性[4,5]。本試驗參照 “微量細胞病變抑制法”(簡稱CPE 抑制法)，采用雞胚成纖維細胞(CEF)/水皰性口炎病毒(VSV)、雞成纖維細胞系(DF-1)/水皰性口炎病毒(VSV)，測定三個批次rChIFN-α的生物學(xué)活性，比較CEF和DF-1兩種細胞在rChIFN-α生物活性測定上的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基和D-Hanks緩沖液均為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。胎牛血清為Sera Pro公司產(chǎn)品。胰蛋白酶-EDTA消化液和青鏈霉素混合液(100X)均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器

二級生物安全柜為青島海爾生物產(chǎn)品。INCUBATOR371二氧化碳培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品。TE2000倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品。HH-ABS-2恒溫水浴鍋為上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.1.3 細胞與毒株

DF-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF雞胚購自乾元浩(鄭州)生物藥廠。CEF由河南省動物疫病預(yù)防控制中心制備。VSV毒株由河南省動物疫病預(yù)防控制中心保存。rCHIFN-α(三個批號分別為202101、202102、202103)由河南省動物疫病預(yù)防控制中心制備與保存。

1.2 方法

1.2.1 CEF細胞的制備

9日齡SPF雞胚經(jīng)外殼消毒后，用鑷子打開氣室，取出雞胚體，置于一次性無菌平皿中。剪去頭、四肢和內(nèi)臟后，雞胚體用PBS洗滌2次，剪碎胚體，再用PBS洗滌2次。加入25 mL DMEM高糖培養(yǎng)基和5 mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中消化20 min后，棄去培養(yǎng)基。加入40 mL DMEM高糖培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次,使細胞團塊分散成為單個細胞，將分散均勻的單個細胞混合物加入到96孔細胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 DF-1細胞的傳代培養(yǎng)

取培養(yǎng)至單層、長勢良好的DF-1細胞，胰蛋白酶消化，然后用DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)重懸。按100 μL/孔的量加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞長滿單層，備用。

1.2.3 樣品稀釋與細胞混合

三個批次待檢rChIFN-α樣品由21至225進行連續(xù)2倍比系列稀釋。待96孔培養(yǎng)板中的CEF和DF-1細胞長至鋪滿單層，用D-Hanks液洗滌細胞兩次，將上述稀釋好的待檢樣品依次分別加入到CEF和DF-1細胞中，每個稀釋度重復(fù)四孔。同時設(shè)置細胞對照組。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h左右。

1.2.4 加入VSV病毒

24 h后，以100 TCID50/mL的濃度加入VSV病毒，100 μL/孔。同時設(shè)置病毒對照組。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-36 h。

1.2.5 觀察結(jié)果

加入VSV病毒24-36 h后，電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，若對照組中各孔細胞的形態(tài)和生長良好，而病毒對照組中各孔細胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮、變圓、破碎、脫落，有75%～100%細胞出現(xiàn)明顯的病變和死亡，則說明試驗設(shè)置的對照系統(tǒng)成立，試驗結(jié)果可信。

1.2.6 生物學(xué)活性單位計算

按照Reed-Muench法計算生物學(xué)活性單位，計算公式為：

距離比=(高于50%的百分數(shù)-50)/(高于50%的百分數(shù)-低分50%百分數(shù))

=(80-50)/(80-20)=30/60=0.5

此批次rChIFN-α待檢樣品稀釋到217.5時能保護半數(shù)細胞免受VSV病毒攻擊損害，該批次rChIFN-α樣品的效價即為185364單位(以IU表示)。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察結(jié)果

將三個批次的rChIFN-α細胞病變孔數(shù)與細胞病變程度進行比較，CEF和DF-1細胞對照組正常，病毒對照組出現(xiàn)典型病變(圖1和圖2)。

A:細胞對照組；B：病毒對照組； C：2.10×107 IU /mL 重組雞α干擾素抗VSV孔；D：4.19×107IU /mL 重組雞α干擾素抗VSV孔

A:細胞對照組；B：病毒對照組； C：2.10×107 IU /mL 重組雞α干擾素抗VSV孔；D：4.19×107IU /mL 重組雞α干擾素抗VSV孔

2.2 結(jié)果計算

2.2.1 rChIFN-α在CEF細胞上的生物學(xué)活性

三個批次rChIFN-α能抑制50%細胞病變的干擾素稀釋度的對數(shù)(log2X)均為22，即rChIFN-α(0.1 mL)稀釋到222時能保護半數(shù)細胞免受損害，計算X=4.19×107IU/mL，即rChIFN-α的效價為4.19×107IU/mL(表1)。相同試驗條件下，細胞對照組各孔細胞狀態(tài)和長勢良好，病毒對照組各孔細胞均出現(xiàn)病變。

表1 重組雞α干擾素在CEF細胞上生物學(xué)活性

2.2.2 rChIFN-α在DF-1細胞上生物學(xué)活性

三個批次rChIFN-α能抑制50%細胞病變的干擾素稀釋度的對數(shù)(log2X)分別為22、22、21，即rChIFN-α(0.1 mL)稀釋到222和221時能保護半數(shù)細胞免受損害，計算X=4.19×107IU/mL、X=4.19×107IU/mL、X=2.10×107IU/mL，即rChIFN-α的效價為4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL、2.10×107IU/mL(表2)。

相同試驗條件下細胞對照組各孔細胞狀態(tài)和長勢良好，病毒對照組各孔細胞均出現(xiàn)病變。高濃度的rChIFN-α?xí)?dǎo)致CEF和DF-1細胞死亡，表明rChIFN-α在CEF和DF-1兩種細胞上存在最適抗VSV活性作用濃度，并非濃度越高抗VSV活性越好。

表2 重組雞α干擾素在DF-1細胞上生物學(xué)活性測定

續(xù)表2 重組雞α干擾素在DF-1細胞上生物學(xué)活性測定

3 結(jié)論

rChIFN-α在CEF和DF-1上生物學(xué)活性效價分別為4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL和4.19×107IU/mL、4.19×107IU/mL、2.10×107IU/mL。鑒于CEF制備繁瑣、成本較高，而DF-1可大量增殖、傳代培養(yǎng)，且培養(yǎng)便捷，因此，DF-1比CEF更適合于rChIFN-α生物學(xué)活性的測定。