李建正，張 麗，劉應(yīng)鵬，朱麗萍，魏志剛,周延州

(1.河南后羿實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 鄭州 450000； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

蟲(chóng)草菌種是從天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中分離而得的蝙蝠蛾擬青霉菌、再由人工液體發(fā)酵培養(yǎng)和固體培養(yǎng)制成蟲(chóng)草菌絲體，其有效成分主要是蟲(chóng)草多糖和甘露醇類似物。蟲(chóng)草多糖是蟲(chóng)草菌絲體含量較高的生物活性物質(zhì)之一，能夠顯著增強(qiáng)肝臟超氧化物歧化酶活性，有明顯的抗氧化、清除氧自由基和羥自由基的作用，具有提高機(jī)體免疫能力，抗病毒作用，具有改善呼吸系統(tǒng)，止咳、化痰、潤(rùn)肺和延緩衰老等藥理作用[1，2]。

杜仲葉中黃酮類物質(zhì)的含量較高，有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗氧化作用，其中苯丙素類化合物中綠原酸、香草酸活性成分的含量較高，抗菌、抗病毒作用較強(qiáng)[3]。楊樹(shù)花含有皂苷、鞣酸、黃酮類多酚物質(zhì)，具有清熱解毒、化濕止痢等藥理作用，對(duì)細(xì)菌性痢疾、腸炎療效較好，還可有效緩解畜禽發(fā)病期間的各種炎癥和應(yīng)激反應(yīng)[4]。

中藥提取物及發(fā)酵中藥是融合現(xiàn)代制藥新技術(shù)的新型產(chǎn)品，具有廣闊的市場(chǎng)空間，有良好的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景。近年來(lái)，發(fā)酵中藥已成為研究熱點(diǎn)。研究表明蛹蟲(chóng)草菌代謝產(chǎn)生的酶系對(duì)中藥有生物轉(zhuǎn)化作用[5]。本研究通過(guò)蛹蟲(chóng)草菌發(fā)酵以提高杜仲和楊樹(shù)花中活性成分含量，再利用杜仲和楊樹(shù)花中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)促進(jìn)蟲(chóng)草菌的生長(zhǎng)，以提高抗菌抗病毒活性物質(zhì)的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蛹蟲(chóng)草斜面ACCC50542(上海保藏生物技術(shù)中心)；楊樹(shù)花粉碎物、杜仲粉碎物(四川恒瑞通達(dá)生物技術(shù)有限公司)；豆粕(濟(jì)南綠之源生物科技有限公司)；麩皮(新鄭面粉廠)、土豆(新鄭農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))、蛋白胨、酵母粉(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸鈣(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50G，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司設(shè)備廠)；恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9270MB，上海一恒儀器廠)；恒溫培養(yǎng)振蕩箱(ZHWY-211B，上海雙旭電子有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1900，上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司)；單人凈化工作臺(tái)(SW-CJ-ID，上海古寧儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Waters e2695，美國(guó)沃特世公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲(chóng)草菌種子液制備

1.3.1.1 種子液培養(yǎng)基制備

麥麩汁5%、土豆汁20%、葡萄糖2%，配制1500 mL培養(yǎng)基，分別制備一級(jí)種子培養(yǎng)液三瓶、二級(jí)種子培養(yǎng)液三瓶、三級(jí)種子培養(yǎng)液三瓶，121 ℃滅菌30 min，放涼備用。

1.3.1.2 種子液制備實(shí)驗(yàn)步驟

將蛹蟲(chóng)草菌種分別接種于三瓶100 mL培養(yǎng)液中，于26 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，得到一級(jí)種子液。

將上述一級(jí)種子液以30%的接種量接種于100 mL培養(yǎng)液中，于26 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，得到二級(jí)種子液。

將上述二級(jí)培養(yǎng)液以30%的接種量接種于200 mL培養(yǎng)液中，于26 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，得到三級(jí)種子液。

1.3.2 蛹蟲(chóng)草發(fā)酵中藥

1.3.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基制備

葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.1%、豆粕1%、麥麩20%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、碳酸鈣0.1%、杜仲和楊樹(shù)花粉碎混合物(4∶6)20%～40%，配制1000 mL培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min，放涼備用。

1.3.2.2 發(fā)酵液制備

將三級(jí)種子液以40 %的接種量接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，總體積為200 mL，于26 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，獲得菌體發(fā)酵液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 最佳中藥添加量

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加20%、30%、40%杜仲和楊樹(shù)花混合物(4∶6)，測(cè)定各項(xiàng)發(fā)酵產(chǎn)物的含量，篩選最佳的添加量。

1.3.3.2 最佳菌種接種量

在中藥添加量一定的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加30%、40%、50%的蟲(chóng)草菌種，測(cè)定各項(xiàng)發(fā)酵產(chǎn)物的含量，篩選最佳的菌種接種量。

1.3.3.3 最佳發(fā)酵溫度

在中藥添加量、菌種接種量一定的條件下，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為20 ℃、25 ℃、30 ℃，測(cè)定各項(xiàng)發(fā)酵產(chǎn)物的含量，篩選最佳的發(fā)酵溫度。

1.3.3.4 最佳發(fā)酵時(shí)間

在中藥添加量、菌種接種量、發(fā)酵溫度一定的條件下，分別培養(yǎng)5 d、7 d、10 d后測(cè)定各項(xiàng)發(fā)酵產(chǎn)物的含量，篩選最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.3.4 多糖、多酚和甘露醇等指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 多糖含量測(cè)定

精密稱取在105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL該葡萄糖溶液置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含葡萄糖50 μg的對(duì)照品溶液。

稱取4.0 g樣品于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取該溶液1 mL，置于500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 mL，分別置于不同試管中，各加3%苯酚溶液2 mL，搖勻，迅速加入硫酸9 mL，搖勻，放置室溫。利用紫外可見(jiàn)分光光度法，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算即得出多糖含量。

1.3.4.2 多酚含量的測(cè)定

精密稱取0.5 g樣品至50 mL容量瓶中，加入適量60%乙醇溶液，超聲30 min，放涼后定容至刻度，過(guò)濾，取上清液稀釋10～20倍后備用。取1.0 mL上述樣品于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL FC試劑和2 mL的15%碳酸鈉溶液，用超純水定容至刻度線，充分混勻后，40 ℃避光顯色1 h，測(cè)定其多酚含量。以不加反應(yīng)液的樣品為空白樣品，上機(jī)檢測(cè)，得到樣品的吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)樣溶度C。

1.3.4.3 甘露醇含量的測(cè)定

精密稱取0.2 g樣品于250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻備用。精密量取上述溶液10 mL于碘瓶中。精密加入高碘酸鈉溶液50 mL，搖勻，水浴加熱15 min，放冷后加入碘化鉀溶液10 mL，搖勻放置5 min，用0.05 mol/L硫代硫酸鈉滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液1 mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，用不加樣品的溶液作為空白進(jìn)行校正。

1.3.4.4 黃酮含量的測(cè)定

精密稱取1 g樣品置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇至總體積15 mL，依次加入硝酸鋁溶液1 mL，醋酸鉀溶液1 mL，搖勻，加水至刻度搖勻，靜置1 h，利用紫外可見(jiàn)分光光度法，于420 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品按上述步驟制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中藥添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

不同中藥添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物影響如圖1所示，當(dāng)加入30%的中藥混合物時(shí)，核心成分蟲(chóng)草多糖的含量最高，且多酚、甘露醇等活性物質(zhì)含量較其它濃度條件下變化不明顯。中藥添加量達(dá)到40%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，選用30%的中藥添加量為最佳。

2.2 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖2，蟲(chóng)草多糖的含量與菌種含量呈正相關(guān)，而多酚、黃酮、甘露醇的含量隨接種量的增加先升高后降低，原因可能是一定數(shù)量的發(fā)酵底物被利用消耗，使其發(fā)酵產(chǎn)物達(dá)到最大值后趨于平穩(wěn)甚至降低。而蟲(chóng)草多糖源于菌種，菌種生長(zhǎng)繁殖，其多糖含量也隨之增加。因此，以40%的菌種接種量作為適宜的指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵。

圖1 不同中藥添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

圖2 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.3 不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

溫度是菌種生長(zhǎng)繁殖的主要影響因素，適宜的溫度能使發(fā)酵效果達(dá)到最大化。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，發(fā)酵產(chǎn)物多糖、多酚、黃酮、甘露醇的含量均在25 ℃達(dá)到最大值，此溫度也是蟲(chóng)草菌生長(zhǎng)繁殖的適宜溫度范圍。

圖3 不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.4 不同時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

由圖4可知，發(fā)酵產(chǎn)物多糖、多酚、黃酮、甘露醇的含量在發(fā)酵7 d 時(shí)達(dá)到最大值。隨著發(fā)酵時(shí)間再延長(zhǎng)，菌種的營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗，活力也隨之降低，故代謝產(chǎn)物也相應(yīng)趨于平穩(wěn)甚至減少。

圖4 不同時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

3 討論

利用真菌發(fā)酵中藥可顯著提高其活性成分含量[6-8]。蟲(chóng)草真菌是一種藥用真菌，其發(fā)酵中藥可以實(shí)現(xiàn)一次發(fā)酵雙向轉(zhuǎn)化，同時(shí)獲得兩種藥物的有效成分，起到協(xié)同增效的作用[9]。

不同的發(fā)酵條件與工藝均會(huì)影響菌種發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著中藥添加量的提高到40%，蟲(chóng)草菌生長(zhǎng)受到抑制，其代謝產(chǎn)生的主要成分多糖也因此減少，對(duì)杜仲和楊樹(shù)花中藥的生物轉(zhuǎn)化作用也相對(duì)減弱，即多酚和甘露醇含量減少，這與徐麗麗[11]等的研究結(jié)果一致，說(shuō)明中藥可以為菌種發(fā)酵提供一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如糖類、微量元素及氨基酸等，供其生長(zhǎng)繁殖[12]。劉朋肖[13]等研究表明，菌種接種量對(duì)蟲(chóng)草菌的生長(zhǎng)和胞外多糖的產(chǎn)生有影響，這與本研究結(jié)果相同。一定量的底物被菌種利用轉(zhuǎn)化后，過(guò)多數(shù)量的菌種沒(méi)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，合適的接種量即可使發(fā)酵達(dá)到最優(yōu)化。不同的菌種其適宜的生長(zhǎng)溫度不同，蟲(chóng)草菌的適宜生長(zhǎng)溫度在25～30 ℃[14]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，蟲(chóng)草菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化的能力最優(yōu)，其繁殖能力最佳且代謝產(chǎn)生的酶活較高，可最大限度地轉(zhuǎn)化杜仲和楊樹(shù)花的藥用成分。

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)蟲(chóng)草菌液雙向發(fā)酵杜仲和楊樹(shù)花的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究中藥的深層發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。