王小東

（四川省成都市青白江區(qū)疾病預防控制中心，四川 成都 610300）

0 引言

沙門菌是常見的革蘭氏陰性菌，隸屬腸道細菌科，會誘發(fā)多種血清感染，進而導致沙門菌病。沙門菌屬于中毒病菌的一種，若誤食發(fā)霉食物則會導致沙門菌中毒，且中毒食物多為蛋奶類與肉類。以上畜牧產品的營養(yǎng)元素豐富，會為沙門菌生長與繁殖提供便利條件。此外，沙門菌具有較強的生命力，其適應能力強，可在食物中存活數(shù)月。沙門菌所致的食物中毒可使牲畜以及人類共同患病，具有較強的傳播性。沙門菌的常規(guī)檢驗技術為血清學實驗，其檢驗周期長，檢驗流程過于繁瑣，所以需要尋求高效且快速的新技術。在生物學技術的推動下，PCR技術得到廣泛使用，其可以對沙門菌進行定量和定性檢驗，具有較完善的快速檢驗體系，檢驗敏感度高。

1 沙門菌概述

沙門菌主要依附在消化系統(tǒng)內，其抗原構成類似于革蘭陰性桿菌，是消化系統(tǒng)疾病的主要致病菌[1]。沙門菌所導致的疾病主要有兩類，第一類為急性腸胃炎，第二類為傷寒、副傷寒。有研究指出，因沙門菌誘發(fā)食物中毒的患者數(shù)量在我國食物中毒總人數(shù)中居于首位，其為食物中毒最常見的細菌[2]。在食物中毒類別中，肉類的沙門菌含量最高，原因是其營養(yǎng)元素多，可促進沙門菌繁衍。若食物中所攜帶的沙門菌達到一定數(shù)量，則會造成人體感染。因此，感染的主要方式為食用沙門菌所污染的食物。

2 沙門菌常用檢驗技術

感染沙門菌后，需要采集被感染者的血液或者排泄物，而后將其作為樣本進行致病菌檢驗[3]。臨床病料以及食物安全檢測的本質原理基本一致，但食物安全檢測的制約因素較多，可能因食物本身的物質構成影響檢驗準確率，且食物可能受到多種致病菌侵襲，或是食物通過人工處理被外界因素影響，這都會損傷沙門菌，也可能導致沙門菌死亡，進而干擾檢驗結果。此外，臨床病料內的沙門菌含量與食物安全檢測樣本中的含量有所差別，臨床病料含量遠高于食物含量。常規(guī)檢驗方法需要提取被感染對象的體內表面抗原，利用生化反應等途徑檢出沙門菌，其反應過程比較繁瑣，檢驗所需時間長，需要大量使用反應試劑，且檢驗靈敏度不高[4]。相比較而言，PCR技術是對常規(guī)檢驗技術的優(yōu)化，可以縮短檢驗時間，精準檢出目的基因的致病菌種類，實現(xiàn)快速檢驗。目前，PCR技術在沙門菌檢驗中的應用率較高，且檢驗效果備受認可。

3 聚合酶鏈式反應（pol ymer ase chain r eaction，PCR）檢驗技術概述

PCR技術的檢驗原理是采集特定DNA片段，利用PCR技術將DNA片段進行放大，即循環(huán)復制所提取的DNA片段，使少量DNA可以不斷增多，最終檢出致病菌。簡而言之，DNA樣本復制是PCR檢驗的核心特征。其檢驗過程是將單鏈DNA作為檢驗樣本，在特定環(huán)境條件下，引物選擇人工合成品，通過PCR技術增加樣本數(shù)量。具體細分為如下3個步驟：①高溫變性；②低溫復性；③適溫延伸。將以上步驟視作一個單位，以循環(huán)方式完成檢驗操作。在PCR實驗期間，需要高度關注溫度變化，原因是溫度不適宜會使樣本DNA中的聚合酶活性喪失，進而影響檢驗結果。因此，每次循環(huán)均需要予以補充、增活操作，保證檢驗結果有效。但PCR技術存在不足之處，如檢驗效率受人為因素制約，若操作人員技能有限，儀器參數(shù)調節(jié)不當則會降低檢驗精準度。PCR檢驗需要使用PCR儀器，其根據(jù)聚合酶衍生而來，可以合理控制檢驗溫度，進而對DNA樣本完成檢驗。PCR技術的典型特點是敏感度與特異度強，可精準且快速檢驗，且有較高的自動化程度。由于PCR技術能夠實現(xiàn)快速檢驗，因此被積極用于多個領域，且在實際運用中整合多項技術，進而衍生出多種PCR檢驗技術。

4 PCR檢驗技術對于沙門菌的檢測應用

4.1 常規(guī)PCR技術

常規(guī)PCR技術在設計引物時選擇特定DNA目標樣本，采取特異保守序列進行設計，可以擴增待檢DNA樣本，利用終產物的擴增反應定性或者定量分析樣本，其檢驗敏感度較高，便于操作，檢驗難度一般[5]。但其存在檢驗不足，可能導致假陽性結果，或者引物不同也會影響檢驗結果的問題。所以，常規(guī)PCR技術需要進行專業(yè)且嚴謹?shù)臋z驗操作，根據(jù)相關標準開展檢驗工作，規(guī)避檢驗影響因素。在常規(guī)PCR檢驗時，可將沙門氏菌毒力基因（hilA）作為檢驗引物，擴增片段選擇497by，可明顯縮短檢驗耗時，同時可以保證檢驗敏感度與準確率。也可將沙門菌屬（inv A）基因作為目的基因，經(jīng)PCR檢驗48h后可獲取檢驗結果。研究樣品選擇加工雞肉或者生肉，在樣品上人工培養(yǎng)沙門菌，此時的PCR檢驗結果與BAx（r）系統(tǒng)的檢驗結果基本一致，準確率可達99%以上。雖然常規(guī)PCR的檢驗速度快，可操作性強，但難以區(qū)分細菌有無活性，進而降低食物中毒的檢出率。原因是活性細菌被認為是食物中毒的主要致病菌，檢出活性細菌可以綜合判斷沙門菌感染情況。此外，常規(guī)PCR技術容易出現(xiàn)樣本污染情況，進而影響致病菌檢出效果。不過目前PCR檢驗技術水平提升，可以消除污染因素。

4.2 多重PCR技術

相比于常規(guī)PCR技術，多重PCR的優(yōu)勢為將1對引物增多至2對及以上，能夠強化DNA反應。多重PCR技術與常規(guī)PCR的檢驗一致性較高，更具高效性和便利性，且檢驗成本低。多重PCR技術被廣泛用于沙門菌等檢驗工作中，可增快檢驗速度。但其同樣具有檢驗劣勢，如檢驗效率一般、敏感度不高等。因此，多重PCR技術需要突破現(xiàn)階段的檢驗條件，優(yōu)化排查檢驗影響因素，進而建立PCR反應體系。李師瑩等[6]研究中，鑒定沙門菌血清型，選擇鼠傷寒沙門菌（Stm4495）、inv A和雞白痢沙門菌（SPUL-2693）作為引物，通過標準菌株-優(yōu)化體系建立四重PCR檢驗流程。結果可見四重PCR的敏感度與特異度較佳，能夠檢出以上3種沙門菌，為快速檢驗提供新型技術支持。

4.3 實時熒光定量PCR技術（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）

FQ-PCR技術最早于1996年被提出，是在常規(guī)的PCR反應體系內加入熒光基團，通過熒光信號實時評估PCR技術的反應過程。該技術是指對目的基因以及標準曲線進行定量分析，而后完成致病菌檢驗操作。該技術從常規(guī)PCR的定性檢驗延伸至定性、定量同時檢驗，其優(yōu)勢為減少PCR標本受污染的情況，具有更高的檢驗特異度和自動化程度，是現(xiàn)階段沙門菌檢驗的常用技術。此外，F(xiàn)Q-PCR的優(yōu)勢之一為多種抗原聯(lián)合檢驗，可將VI抗原基因或者H抗原基因等多種抗原作為引物，以PCR擴增方式檢驗傷寒沙門菌，其對于基因擴增的敏感度高，可以明顯提升傷寒疾病的檢出率，進而指導醫(yī)生疾病的早期診斷與治療工作。FQ-PCR技術可以有效且快速地檢出特定樣本內的沙門菌，其敏感度可達10cfu/g，檢驗時間約是4-10h，且獲得的檢驗結果比較精準。以往研究將實驗細菌或者食物作為目標樣本，利用FQPCR技術進行檢驗，發(fā)現(xiàn)其檢驗敏感度達到102cfu/ml，結果獲取時間在24h內，說明FQPCR技術使得沙門菌檢驗手段更具科學性和專業(yè)性。目前，相關研究細致分析FQ-PCR檢驗所需環(huán)境條件和FQ-PCR技術特征，通過編碼方式確定實驗目標，并整合實驗引物需求，進而建立新型檢驗方法，證實通過其他物質性質的分析，能夠反映沙門菌特征，而適當調節(jié)溫度可以有效識別細菌種類?；谝陨霞夹g前提，使用FQ-PCR技術檢驗畜牧產品中的沙門菌含量，通過對兩種肉類樣本的檢驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Q-PCR的檢驗敏感度約是12cfu/25g，檢驗周期在10h內，且檢驗流程快捷、便利，具有較高的檢驗特異度。但需注意的是，F(xiàn)Q-PCR技術的成本較高，對于檢驗設備的功能要求較高，這是影響其推廣使用的制約性因素之一。田賽[7]研究中通過FQ-PCR技術檢驗沙門菌，樣本選擇海鮮與糞便，結合omp F基因序列科學化設計引物，建立FQ-PCR檢驗方法，并分析該技術的敏感度、特異度與穩(wěn)定性。結果顯示，F(xiàn)Q-PCR技術能夠擴增沙門菌多個型別的基因組DNA，不擴增非沙門菌病菌的基因組DNA，特異度良好。其對于陽性質粒模板的實際敏感度是0.1ng/L，而對于菌株基因組DNA的實際敏感度是10CFU/ml，能夠在短時間檢出沙門菌陽性菌株。此外，F(xiàn)Q-PCR的重復性比較強，經(jīng)過5次反復試驗后，Ct值變異系數(shù)不超過0.8%，證明FQ-PCR技術的敏感度、特異度高，且有良好穩(wěn)定性，可以用于沙門菌的相關檢驗工作。

4.4 免疫捕捉PCR技術

免疫捕捉PCR是將PCR擴增技術有效整合于免疫捕捉技術，其檢驗對象是病原體，利用特異抗體有效捕捉抗原微生物，而后通過基因組序列引物開展PCR擴增操作，再通過檢測擴增后的產物能夠分析完整病原體信息，進而保證檢驗特異度。此外，在免疫捕捉與擴增過程中，樣本體積會有所擴大，因此檢驗敏感度會隨之提升。該技術可細分成以下步驟：第一，抗體固相化，在微量滴定板、瓊脂糖凝膠顆粒或者ep p end orf管等固相載體表面包被特異抗體。第二，抗原捕捉，孵育樣本和所包被的抗體，使其能夠吸附抗原微生物，進而完成抗原捕捉操作。第三，制備模板，利用加熱的方式促使DNA病毒釋放出基因組DNA，利用逆轉錄制形式釋放RNA病毒的基因組RAN，將c DNA用作模板。第四，PCR擴增，擴增反應借助特異引物完成，可以使用內外兩對引物，通過套式PCR完成擴增操作，以此保證檢驗特異度。第五，檢測擴增物，使用寡核苷酸探針以及瓊脂糖凝膠電泳雜交等多種形式進行檢驗，分析擴增片段的序列。免疫捕捉技術具有操作簡單且檢驗快速的優(yōu)勢，能夠基本滿足大規(guī)模樣本的篩選需求，可以在短時間內檢出樣本中的沙門菌含量，可用于商品檢驗檢疫、食品衛(wèi)生檢測、臨床疾病診斷等多個領域。

4.5 免疫磁珠分離PCR（immunomagnetic bead separation PCR，IMS-PCR）技術

IMS-PCR最早于2009年被用于沙門菌的檢驗工作中，其操作便利性強，檢驗時間短，對于沙門菌的檢出率高。IMS-PCR對于牛乳沙門菌的檢驗敏感度約是9cfu/ml，檢驗時間約是7h，能夠顯著提升沙門菌檢驗的時效性以及敏感度。IMS-PCR需對目標菌抗體與磁珠間進行包被處理，進而獲得免疫磁珠，再結合于樣本內目標菌的抗原抗體，最后通過磁場作用使食物基質內的目標菌被有效分離。該技術是對FQ-PCR以及免疫磁珠分離的高效整合，同時具備以上兩種技術的檢驗優(yōu)勢，對于沙門菌的檢驗速度更快，準確度更高。但食物基質具有較高的復雜性，且食物種類不同，其檢驗條件以及食源性致病菌分布有所差異，需要合理選擇檢驗方法，可以針對性開展檢驗工作，所以其檢驗技術要求高?，F(xiàn)階段，免疫磁珠分離FQ-PCR技術的使用范圍較廣，被用于雞胸肉、豬肉以及牛奶等食物沙門菌檢驗工作中。目前，檢驗過程中不斷優(yōu)化免疫磁珠使用量和樣本菌液具體的反應時間，選取典型性的沙門菌，可以提高免疫磁珠的檢驗特異度，增強其捕獲能力。此外，將ttr沙門菌基因作為靶基因，有效構建FQ-PCR體系能夠優(yōu)化沙門菌免疫磁珠分離FQ-PCR檢驗技術，顯著縮短檢驗所需時間，是沙門菌檢驗的高效手段。李亞茹等[8]研究中采取免疫磁珠分離聯(lián)合FQ-PCR檢驗技術，對蝦中的沙門菌進行檢驗，免疫磁珠由抗沙門菌多克隆抗體以及納米磁珠進行制備，對反應條件進行適度優(yōu)化，利用Ⅱ訂S法進行檢驗，引物為沙門菌舸基因，建立檢驗體系。選擇沙門菌4株進行檢驗，評估敏感度與特異度。結果可見免疫磁珠添加量的最合理用量是100皿，樣本菌液以及免疫磁珠的反應最佳時間是30min，該技術對于蝦內部沙門菌的檢出率高，檢驗時間短于6h。證實免疫磁珠分離聯(lián)合FQ-PCR能夠預防沙門菌所致的食源性疾病，在沙門菌檢驗中的可行性高。

綜上，在沙門菌檢驗技術中，PCR技術的操作便利，檢驗結果準確且高效[9-13]，是現(xiàn)階段應用比較廣泛的檢驗技術之一。相比于常規(guī)檢驗技術，PCR技術的優(yōu)勢明顯，尤其是FQPCR、免疫捕捉PCR技術與IMS-PCR技術不僅能縮短檢驗耗時，還能提升檢驗準確度。雖然以上PCR檢驗技術仍存在不足之處，但其在衛(wèi)生學評價以及多種疾病的臨床診斷中占據(jù)重要地位。在未來研究中，可積極引入新技術與先進科技，不斷優(yōu)化PCR對于沙門菌的檢驗技術[14-16]，并突破PCR檢驗過程中的環(huán)境條件約束，提高PCR技術的適用性。