梁結(jié)斐 陳震堯 吳偉斌

1.肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)院，廣東肇慶 526020；2.廣東省肇慶市中醫(yī)院藥劑科，廣東肇慶 526020；3.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東肇慶 526020

《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》數(shù)據(jù)顯示，我國18 歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%[1]。國內(nèi)研究表明，胰島β 細(xì)胞功能減退是我國居民2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）遺傳易感性的主要因素[2]，而高血糖[3]及高血脂[4]是誘發(fā)胰島β 細(xì)胞功能減退的常見原因。上述兩種因素?fù)p傷胰島β 細(xì)胞的機制與誘發(fā)氧化應(yīng)激[5]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]、線粒體功能障礙[7]及自噬[8]有關(guān)，加上與胰島β 細(xì)胞自身的低抗氧化應(yīng)激能力[9]的共同作用下，機體逐漸發(fā)展為糖尿病。四氧嘧啶（alloxan，ALX）是一種常見的用于制備糖尿病在體動物或離體細(xì)胞模型的細(xì)胞毒性試劑，可通過升高細(xì)胞內(nèi)活性氧及誘發(fā)胰腺炎癥等方式誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡或壞死[10-11]。番石榴葉（Psidium guajava leaves，PGL）是桃金娘科植物番石榴的葉，是兩廣及福建地區(qū)的一種常見茶飲原料，其提取物具有鎮(zhèn)痛[12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14]及護(hù)肝[15]等多種藥理作用。在抗糖尿病方面，PGL 提取物已被證明可通過抑制NF-κB 通路及激活A(yù)MPK 通路等機制對糖尿病大鼠的心肌[16]、骨骼肌及肝細(xì)胞[17]實現(xiàn)保護(hù)作用。但PGL提取物能否對胰腺β 細(xì)胞具有保護(hù)作用及其可能機制尚未清楚。本研究利用ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，旨在探討PGL 水提物對INS-1 細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機制，為進(jìn)一步開發(fā)利用PGL水提物提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究對象為大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株INS-1，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

PGL 水提物干粉（江西沐恩堂生物科技有限公司，批號：200517）；RPMI 1640（美國Hyclone 公司，貨號：8121303）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號：13011-8611）；2-巰基乙醇、ALX、TBST即用干粉（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：M6230、A800714、T854550）；CCK-8（上海MedChemExpress 公司，貨號：HY-K0301）；發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒、抗熒光淬滅封片液（含Hoechst 33342）、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Rhodamine 123（RHD 123）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、裂解液、封閉液、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0069、P0133、C1062、S0033、C2007、P0010、P0028、P0013、P0252、P0018A）；Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3、GRP78、CHOP、Nrf2、HO-1、Tubulin、Lamin B1 及Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號：AF6139、AF0120、AF7022、AF5366、AF5280、AF0639、AF7018、AF7011、AF5161、S0001）；PVDF膜（美國Millipore 公司，貨號：IPVH00010）。

MCO-18AC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Panasonic 公司）；SPARK 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；BX53正置熒光顯微鏡及Ⅸ73 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；SimpliNano 核酸蛋白檢測儀（美國GE 公司）；Powerpac Universal 電泳儀電源（美國Bio-Rad 公司）；iBright FL1000 顯影儀（美國Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株INS-1按照RPMI 1640+10%FBS+50 μmol/L 2-巰基乙醇的配方配置完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；后續(xù)實驗分組如表1。

表1 實驗分組及誘導(dǎo)條件

1.2.2 細(xì)胞活力檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后按每孔1×103個細(xì)胞鋪入96 孔板，無血清培養(yǎng)過夜，然后按表1 分組換入相應(yīng)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)相應(yīng)時間后，換入含CCK8 的完全培養(yǎng)基后，把微孔板放入培養(yǎng)箱中避光孵育60 min，最終利用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm/620 nm（檢測波長/ 參照波長）波長處的吸光度，以0 mmol 組或Control 組為100%換算各組相對存活率，每次實驗每組設(shè)置6 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.3 化學(xué)自發(fā)光法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP 的含量 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后按每孔1×103個細(xì)胞鋪入全白96 孔板，無血清培養(yǎng)過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml的分組換入相應(yīng)培養(yǎng)基并誘導(dǎo)4 h 后，按發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒要求換入檢測液后，用酶標(biāo)儀檢測孔板中化學(xué)發(fā)光強度，每次實驗每組設(shè)置6 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察凋亡形態(tài)學(xué)、細(xì)胞內(nèi)ROS 及線粒體膜電位 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后按每孔1×105個細(xì)胞鋪入預(yù)先放置蓋玻片的6 孔板制備細(xì)胞爬片，無血清培養(yǎng)過夜，按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應(yīng)培養(yǎng)基并誘導(dǎo)24 h 后，取細(xì)胞爬片按照Hoechst 33342 染色液的說明書進(jìn)行封片染色，利用正置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每次實驗每組設(shè)置3 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后按每孔1×105個細(xì)胞鋪入6 孔板，無血清培養(yǎng)過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應(yīng)培養(yǎng)基并誘導(dǎo)4 h 后，吸棄上清后，加入配置好的ROS 或Rhodamin 123 檢測試劑，避光37℃孵育15 min，PBS 蕩洗3 次，利用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每次實驗每組設(shè)置3 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS 及線粒體膜電位 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后按每孔1×105個細(xì)胞鋪入6 孔板，無血清培養(yǎng)過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應(yīng)培養(yǎng)基并誘導(dǎo)4 h 或24 h 后，消化并以1 000 r/min、半徑8.2 cm、離心5 min收集細(xì)胞，吸棄上清后，按AnnexinV-FITC、活性氧及RHD 123 試劑盒要求進(jìn)行孵育，最后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每次實驗每組設(shè)置3 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.6 Western blot 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后按每孔1×105個細(xì)胞鋪入6 孔板，無血清培養(yǎng)過夜，然后按Control，ALX20，PGL 25、50、100 μg/ml 的分組換入相應(yīng)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)4 h 或24 h 后，消化離心收集細(xì)胞，向離心管中加入200 μl 裂解液提取總蛋白，然后利用核酸蛋白定量儀進(jìn)行蛋白定量，均一化蛋白濃度后，加入上樣緩沖液制備蛋白樣品。電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，配置好所需檢測蛋白的一抗（1∶1 000），低溫?fù)u床4℃過夜孵育，次日以PBST 蕩洗后，室溫孵育二抗（1∶5 000）1 h，最終利用顯影儀檢測以獲得蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗；圖像資料利用Image J 進(jìn)行半定量分析，GraphPad 8 軟件制作數(shù)據(jù)圖，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 損傷細(xì)胞活力的影響

為確立合適的損傷濃度，梯度濃度的ALX 干預(yù)INS-1 細(xì)胞24 h 后發(fā)現(xiàn)，5 mmol 的ALX 組細(xì)胞活力低于0 mmol 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A），且高濃度ALX 組的細(xì)胞活力低于低濃度ALX 組，因此根據(jù)研究需求選擇損傷程度適中的濃度進(jìn)行后續(xù)的研究，最終以20 mmol ALX 為建立損傷模型的誘導(dǎo)濃度。確定了損傷濃度后，為建立非損傷性的氧化應(yīng)激模型，確立相應(yīng)的誘導(dǎo)時間，以20 mmol ALX 誘導(dǎo)不同時間后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ALX 誘導(dǎo)時間達(dá)到6 h 時，INS-1 細(xì)胞活力低于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B），故確定非損傷性的氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)時間為4 h。為確立研究所使用的藥物劑量，梯度濃度的PGL 水提物干預(yù)INS-1 細(xì)胞24 h 后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PGL 水提物濃度達(dá)到200 μg/ml 時，INS-1 細(xì)胞活力低于0 μg/ml 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1C），故后續(xù)研究使用不高于200 μg/ml 的劑量進(jìn)行。建立穩(wěn)定的ALX 損傷模型并確立安全給藥劑量后，在此基礎(chǔ)上對PGL 水提物保護(hù)作用開展研究，結(jié)果顯示，25 μg/ml 的PGL 水提物組INS-1 細(xì)胞活力高于ALX組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；100 μg/ml 的PGL水提物組INS-1 細(xì)胞活力低于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 藥物對INS-1 細(xì)胞活力的影響

2.2 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

20 mmol ALX 干預(yù)24 h 可誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞凋亡，利用Hoechst 33342 染色后在熒光顯微鏡下觀察，ALX20 組呈現(xiàn)典型核固縮細(xì)胞顯著增多（圖2A），而PGL 水提物能劑量依賴地減少核固縮的發(fā)生。利用Annxin V-FITC 法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測也發(fā)現(xiàn)，PGL水提物能劑量依賴地減少凋亡細(xì)胞的占比（圖2B），逆轉(zhuǎn)ALX 所誘發(fā)的凋亡，保護(hù)INS-1 細(xì)胞。ALX20 組Bax 及Cleaved-Caspase 3 蛋白的表達(dá)量高于Control組，Bcl-2 的表達(dá)則低于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PGL 水提物Bax 及Cleaved-Caspase 3蛋白的表達(dá)量低于ALX20 組，高于Control 組，Bcl-2的表達(dá)高于ALX20 組，低于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖2 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞凋亡的影響（400×）

圖3 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞Bcl-2、Bax 及Cleaved-Caspase 3 表達(dá)的影響

2.3 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞內(nèi)ATP 含量及線粒體膜電位的影響

經(jīng)過20 mmol ALX 誘導(dǎo)4 h 建立氧化應(yīng)激模型，其細(xì)胞內(nèi)ATP 含量及線粒體膜電位低于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PGL 水提物各劑量組細(xì)胞內(nèi)ATP 含量及線粒體膜電位均高于ALX20 組，低于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4～5）。

圖4 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞內(nèi)ATP 含量的影響

圖5 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（400×）

2.4 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及抗氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響

利用ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞4 h 建立氧化應(yīng)激模型，可見ALX20 組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量高于Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PGL 水提物各劑量組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量皆低于ALX20 組，高于Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。Nrf2 通路是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化應(yīng)激通路，上調(diào)該通路功能可有效保護(hù)胰腺細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，結(jié)果顯示，PGL水提物各劑量組Nrf2 及HO-1 蛋白的表達(dá)量皆高于ALX20 組和Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且PGL 水提物各劑量組的Nrf2 核轉(zhuǎn)位的程度高于ALX20 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖7）。

圖6 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響

圖7 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞Nrf2 和HO-1 表達(dá)及Nrf2 核轉(zhuǎn)位的影響

2.5 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

ROS 升高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡是三種常見的并行機制介導(dǎo)糖尿病機體多種臟器的病變，利用ALX誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞4 h 后發(fā)現(xiàn)，ALX20 組的GRP78 及CHOP 兩個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特征蛋白的表達(dá)高于Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PGL 水提物各劑量組的GRP78 及CHOP 表達(dá)量均低于ALX20 組，高于Control 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖8）。

圖8 PGL 水提物對ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞GRP78 和CHOP 表達(dá)的影響

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，2020 年，我國大陸地區(qū)成年人糖尿病患病率為12.8%，糖尿病前期患病率高達(dá)35.2%[18]，對當(dāng)下及未來一段時間內(nèi)中國人民的身體健康及國家醫(yī)療衛(wèi)生支出都將產(chǎn)生巨大的負(fù)擔(dān)。研究表明[19]，我國居民的飲食習(xí)慣改變使得近年高血糖高血脂等問題日漸加劇，而過高的血糖及血脂對胰腺等臟器產(chǎn)生顯著糖脂毒性，誘發(fā)全身多種細(xì)胞胰島素抵抗，進(jìn)而增加胰腺細(xì)胞的工作負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致胰腺功能減退并最終引發(fā)糖尿病[20]。研究表明，糖脂毒性主要通過氧化應(yīng)激[21]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22]、線粒體功能紊亂[23]及炎癥[24]等機制介導(dǎo)了胰腺細(xì)胞的功能失調(diào)及凋亡，而天然產(chǎn)物在對抗上述致病機制方面具有很好的療效[25]。ALX 是一種能特異性損傷胰島β 細(xì)胞、建立糖尿病動物模型的造模劑[26]，常用于構(gòu)建體內(nèi)外胰島β 細(xì)胞損傷模型。

本研究通過ALX 誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株INS-1 建立胰島β 細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型，研究PGL 水提物對胰島β 細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機制。已有研究表明，過度升高的活性氧結(jié)合細(xì)胞內(nèi)相對較弱的抗氧化應(yīng)激能力，可引發(fā)線粒體功能紊亂[27]，使得葡萄糖利用能力下降，ATP 合成減少，進(jìn)而線粒體質(zhì)量下降，膜電位丟失，最終引發(fā)凋亡。本研究結(jié)果顯示，非毒性濃度的25～100 μg/ml PGL 水提物能有效對抗20 mmol ALX 所誘導(dǎo)的INS-1 細(xì)胞活力下降，呈劑量依賴性地恢復(fù)細(xì)胞活力，提高細(xì)胞內(nèi)ATP含量，回升線粒體膜電位，減少核固縮細(xì)胞占比，降低細(xì)胞凋亡率，其機制可能與PGL 水提物可改善線粒體功能、提高Bcl-2 表達(dá)、降低Bax 表達(dá)并減少Cleaved-Caspase 3 的表達(dá)有關(guān)，該機制最終阻斷了Caspase 3 途徑所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)ALX 誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞損傷的作用。

ALX 誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡，除與線粒體功能紊亂有關(guān)外，還與上調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[28]有關(guān)，且前期研究表明PGL 提取物具有顯著體外抗氧化的作用。本研究結(jié)果顯示，PGL 水提物能有效降低細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，其調(diào)控機制與PGL 水提物能上調(diào)Nrf2 及HO-1 蛋白表達(dá)并促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位、增強細(xì)胞抗氧化應(yīng)激通路功能有關(guān)。除此以外，PGL 水提物還能下調(diào)GRP78 及CHOP 的表達(dá)，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過多靶點的作用實現(xiàn)對ALX 誘導(dǎo)體外INS-1細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，但PGL 水提物能否在ALX 誘導(dǎo)的在體糖尿病模型上表現(xiàn)出胰腺保護(hù)作用，仍有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，PGL 水提物可通過調(diào)控線粒體功能、減輕細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對ALX 誘導(dǎo)體外胰島細(xì)胞凋亡模型實現(xiàn)保護(hù)作用。