肖新波，何衍彪,2，李意成，周蕓蕓，尹 周

（1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南省高校農(nóng)作物有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000；2. 婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南 婁底 417000）

香樟[Cinnamomum camphora（Linn）Presl]為樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠喬木，廣泛分布于華南地區(qū)，是重要的自然生態(tài)樹種；同時(shí)香樟集香料、藥用、材用等多功能于一體， 是寶貴的芳香植物資源[1-2]。不同品系香樟樹揮發(fā)油所含化學(xué)成分各有不同，據(jù)《中國植物志》記載樟樹按精油化學(xué)成分可分為本樟、芳樟和油樟3 個(gè)類型，隨著研究的不斷深入，陸續(xù)有新的化學(xué)型被發(fā)現(xiàn)[3]。

劉亞等[4]、郭向陽[5]、邱米等[6]、王瑋琴等[7]分別對香樟樹葉片、花和果實(shí)揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，但由于品系、采集時(shí)間、生長環(huán)境等對揮發(fā)油的含量和成分有一定的影響，不同文獻(xiàn)的檢測結(jié)果難以分析出香樟不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分的差異。研究還發(fā)現(xiàn)，樟樹中的揮發(fā)油成分具有良好地抑菌效果[8-10]。但關(guān)于香樟不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分差異與抑菌活性之間關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。筆者在前期研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，香樟果實(shí)揮發(fā)油對芒果炭疽病、番茄灰霉病等具有強(qiáng)烈的抑菌活性，而葉片揮發(fā)油抑菌活性不明顯，因此，筆者擬利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對香樟果實(shí)、葉片揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析，結(jié)合前人研究結(jié)果進(jìn)一步探尋香樟果實(shí)揮發(fā)油的主要抑菌活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮的香樟葉片和果實(shí)，分別于2021 年5 月、9月采集自湖南省婁底市湖南人文科技學(xué)院校園內(nèi)。試驗(yàn)主要試劑有石油醚（天津富宇精細(xì)化工有限公司）、無水硫酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）等，均為分析純。供試菌株為番茄灰霉病病菌（Botrytis cinereaPersoon），由海南大學(xué)劉銅教授團(tuán)隊(duì)提供。

試驗(yàn)主要儀器設(shè)備有7890B-5977B 型GC/MS 聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）、R-201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）、FA2204B 型電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）、TopPette 單道手動(dòng)可調(diào)移液器[大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取稱取適量新鮮的香樟樹葉，剪碎，或稱取適量新鮮的香樟果實(shí)置于圓底燒瓶中，電熱套保溫；并將另一圓底燒瓶加熱產(chǎn)生的水蒸氣用玻璃管輸入盛有樣品的圓底燒瓶底部，水蒸氣從盛有樣品的圓底燒瓶底部將揮發(fā)油帶出，經(jīng)冷凝管冷凝后得到油水混合物，當(dāng)冷凝水變得清澈后停止加熱。合并油水混合物，用石油醚萃取3 次。將合并后的石油醚萃取液用無水硫酸鈉脫水過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，即得具有特殊香味的淡黃色揮發(fā)油，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 揮發(fā)油抑菌試驗(yàn)在超凈工作臺(tái)上用移液器及滅菌槍頭取適量果實(shí)揮發(fā)油和葉片揮發(fā)油加入含500 倍揮發(fā)油體積的滅菌PDA 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基溫度約45℃）的三角瓶中，混勻，倒入直徑為9 cm 培養(yǎng)皿中（每皿15 mL 左右），靜置，紫外燈滅菌30 min。將菌落接入培養(yǎng)皿正中央，每隔2 d 觀察菌落的生長狀況，5 d 后用十字交叉法測量菌落直徑。按公式（1）計(jì)算相對抑制率。

1.2.3 GC/MS 分析條件（1）GC 條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm)，色譜柱流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為230℃，分液比為20 ∶1，進(jìn)樣量為1 μL，程序升溫為柱溫70℃，以10℃/min 的速率升至280℃。（2）MS 條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度150℃，電子能量70 eV，檢測器電壓350 V，接口溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍50～500 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟揮發(fā)油抑菌效果

由圖1 可知，番茄灰霉病病菌在香樟果實(shí)揮發(fā)油500×稀釋下的培養(yǎng)基上不能生長，表明香樟果實(shí)揮發(fā)油稀釋500 倍后對番茄灰霉病病菌的相對抑制率高達(dá)100%；番茄灰霉病病菌在香樟葉片揮發(fā)油500×稀釋下的培養(yǎng)基上可正常生長，表明香樟葉片揮發(fā)油稀釋500 倍后對番茄灰霉病病菌的相對抑制率為0%。

圖1 番茄灰霉病病菌在香樟揮發(fā)油處理的培養(yǎng)基上的生長情況

2.2 香樟揮發(fā)油化學(xué)成分分析

圖 2 為香樟葉片、果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分的總離子流圖，各組分經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫檢索，從香樟葉片、果實(shí)揮發(fā)油中共鑒定出70 種化學(xué)成分，包括烴類35 種、醇類17 種、酯類6 種、醛類4 種、酮類3 種、酚類2 種、醚類2 種和氧化物1 種（表1）。其中葉片揮發(fā)油中鑒定的化學(xué)成分27 種，占葉片揮發(fā)油總含量的94.67%；果實(shí)揮發(fā)油中鑒定的化學(xué)成分52 種，占果實(shí)揮發(fā)油總含量的95.81%。

表1 香樟葉片和果實(shí)揮發(fā)油成分和含量

續(xù)表1

圖2 香樟果實(shí)揮發(fā)油總離子流圖

通過比對分析，葉片和果實(shí)揮發(fā)油的化學(xué)成分存在差異，其中葉片揮發(fā)油和果實(shí)揮發(fā)油都具有的化合物有9 種，分別是烴類4 種，包括石竹烯、蛇麻烯、(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-四甲基-12-氧雜雙環(huán)(9.1.0)十二烷基-3,7-二烯、虎鯊烯；醇類2 種，包括芳樟醇和橙花叔醇2；酮類1 種，為樟腦；酯類1 種，為（草酸，1-甲基戊酯）；氧化物1 種，為石竹烯氧化物。

葉片揮發(fā)油特有的化學(xué)成分有16 種，果實(shí)揮發(fā)油所特有的化學(xué)成分為45種。相對于葉片揮發(fā)油來說，果實(shí)揮發(fā)油所特有或含量較高的是β-水芹烯（8.62%）、芳樟醇（9.64%）、檸檬醛（6.60%）、樟腦（8.49%）、黃樟素（11.75%）、丁香酚甲醚（8.47%）。

3 結(jié)論與討論

采用水蒸氣蒸餾法提取香樟葉片和果實(shí)中的揮發(fā)油，利用GC-MS 法分別鑒定出27 和52 種化學(xué)成分，可見葉片與果實(shí)的揮發(fā)油所含化學(xué)成分存在較大差異，果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分更加多樣、復(fù)雜。植物不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分往往差異比較大，不同部位的揮發(fā)油在抑菌活性方面可能也存在一定差異[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，香樟果實(shí)揮發(fā)油對番茄灰霉病具有強(qiáng)烈的抑菌活性，而葉片揮發(fā)油抑菌活性不明顯。香樟果實(shí)揮發(fā)油所特有或含量較高的是β-水芹烯、芳樟醇、檸檬醛、樟腦、黃樟素、丁香酚甲醚等，其中檸檬醛、芳樟醇等被報(bào)道具有較好的抑菌活性[12-15]。李建菲[16]研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚和異丁香酚對多種病原菌具有較強(qiáng)抑制效果；而宋澤華等[17]研究發(fā)現(xiàn)，多種基于丁香酚的異唑啉類化合物對油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、番茄早疫病菌和辣椒疫霉病菌具有較好的抑菌活性。

與香樟葉片揮發(fā)油相比，香樟果實(shí)揮發(fā)油具有更強(qiáng)的抑菌活性。事實(shí)證明，對香樟果實(shí)揮發(fā)油特有的化學(xué)成分進(jìn)行研究，是篩選天然抑菌活性物質(zhì)的有效途徑。除了前人報(bào)道的檸檬醛、芳樟醇、異丁香酚外，香樟果實(shí)揮發(fā)油特有的化學(xué)成分中是否還有其他活性抑菌物質(zhì)有待于進(jìn)一步研究。