王麗 盧發(fā)菊 李薇 馬明福

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最為嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎臟疾病的主要原因。近年來，DN發(fā)病率急劇上升，已成為嚴重的全球公共衛(wèi)生問題[1]。最近研究表明，在高血糖刺激下足細胞損傷并導(dǎo)致腎小球濾過率下降和持續(xù)性蛋白尿，是DN早期發(fā)生的關(guān)鍵因素[2]。因此，減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷可能對DN防治具有重要價值。類葉升麻苷又叫麥角甾苷，是一種重要的、在多種植物中分布的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護、抗腫瘤等生物活性。研究顯示，類葉升麻苷對PC12細胞缺糖缺氧損傷具有保護作用[3]。此外，類葉升麻苷可以通過調(diào)節(jié)TH22淋巴細胞的趨化性和增殖來減輕系膜細胞炎性損傷，改善尿蛋白排泄[4]。然而，筆者發(fā)現(xiàn)類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷是否具有保護作用鮮有報道。近年來，微小RNA(miRNA)作為天然的存在的非編碼調(diào)節(jié)分子受到越來越多的關(guān)注，且多種miRNA通過調(diào)節(jié)足細胞的丟失和功能障礙在DN進展中發(fā)揮作用[5,6]?，F(xiàn)有研究顯示，miR-496在2型糖尿病患者外周血單核細胞中表達下調(diào)，過表達miR-496可減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷[7,8]。本研究通過觀察類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷以及miR-496表達的影響，探討其潛在分子機制，以期為類葉升麻苷用于防治DN提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎臟足細胞(MPC5)購自上海通派生物科技公司；γ干擾素購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Invitrogen公司；類葉升麻苷(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；miR-496模擬物(miR-496 mimics)、模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-496抑制物(anti-miR-496)、抑制物陰性對照購(anti-miR-NC)自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海凱基生物；兔源腎病蛋白(nephrin)單克隆抗體、兔源足突蛋白(podocin)單克隆抗體、兔源Bcl-2單克隆抗體、兔源Bax單克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體以及山羊抗兔IgG二抗購于美國Abcam公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Mix購于北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):參照黎妮等[9]方法采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和γ干擾素)于33℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MPC5細胞。細胞80%融合時進行傳代，更換為含5%胎牛血清、不含γ干擾素的培養(yǎng)基于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d使其分化成熟。實驗前用不含γ干擾素的培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24 h后備用。

1.2.2 實驗分組:取生長狀態(tài)良好的MPC5細胞接種6孔板，按照實驗分組進行如下處理。①正常糖(NG)組：補充5 mmol/L葡萄糖；高糖(HG)組：補充30 mmol/L葡萄糖；高糖+類葉升麻苷-低劑量(HG+AS-L)組：補充30 mmol/L葡萄糖和1.0 μmol/L類葉升麻苷；高糖+類葉升麻苷-中劑量(HG+AS-M)組：補充30 mmol/L葡萄糖和10.0 μmol/L類葉升麻苷；高糖+類葉升麻苷-高劑量(HG+AS-H)組：補充30 mmol/L葡萄糖和100.0 μmol/L類葉升麻苷。各組孵育48 h后，分別檢測細胞凋亡、nephrin和podocin蛋白表達以及miR-496表達情況。②為證實類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷的保護作用與調(diào)控miR-496表達有關(guān)，將MPC5細胞分為HG+miR-NC組、HG+miR-496組、HG+AS+anti-miR-NC組、HG+AS+ anti-miR-496組。HG+miR-NC組、HG+miR-496組為利用LipofectamineTM 2000將miR-NC、miR-496分別轉(zhuǎn)染60%融合的MPC5細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用補充30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育細胞48 h。HG+AS+anti-miR-NC組、HG+AS+anti-miR-496組為將anti-miR-NC、anti-miR-496分別轉(zhuǎn)染MPC5細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用補充30 mmol/L葡萄糖和100.0 μmol/L類葉升麻苷的培養(yǎng)液孵育細胞48 h。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:用胰蛋白酶處理各組貼壁細胞獲得單細胞懸液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并離心去除上清液后，加入195 μl結(jié)合溶液輕柔重懸細胞。然后，加入5 μl的Annexin V-FITC輕輕混勻，然后加入10 μl的PI染色液。在20℃下暗室中孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測nephrin、podocin、Bcl-2和Bax蛋白表達:加入細胞裂解液冰上裂解細胞，獲得細胞總蛋白，定量后煮沸3 min使其變性。取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后利用濕法轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。在封閉和洗滌后，將膜與一抗溶液(nephrin為1∶5 000，podocin、Bcl-2和Bax為1∶2 000)在37℃下孵育45 min。充分洗滌后，膜與二抗在37℃孵育45 min。再次洗膜后，用增強化學(xué)發(fā)光顯色液暗室顯影。凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-496表達:Trizol試劑提取各組細胞的總RNA。提取后，利用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Mix通過RT-qPCR擴增cDNA模板。U6作為miR-496的內(nèi)部對照，2-ΔΔCt法分析miR-496相對表達量。miR-496上游引物5’-GCCGAGTGAGTATT ACATGGCC-3’，miR-496下游引物5’-TGAGTATTACATGGCCAATCTC-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2 結(jié)果

2.1 類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響 與NG組比較，HG組MPC5細胞中nephrin和podocin蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H組MPC5細胞中nephrin和podocin蛋白表達顯著升高(P<0.05)，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3組間nephrin和podocin蛋白表達比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 nephrin和podocin蛋白表達

表1 類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響

2.2 類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞凋亡的影響 與NG組比較，HG組MPC5細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H組MPC5細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3組間上述指標比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 類葉升麻苷高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞凋亡的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞凋亡的影響

2.3 類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞中miR-496表達的影響 與NG組比較，HG組MPC5細胞miR-496表達顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H組MPC5細胞miR-496表達顯著升高(P<0.05)，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3組間miR-496表達比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞中miR-496表達的影響

2.4 上調(diào)miR-496對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-496組MPC5細胞miR-496表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，nephrin和podocin蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 上調(diào)miR-496對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞中nephrin和podocin蛋白表達的影響

圖3 nephrin和podocin蛋白表達

2.5 上調(diào)miR-496對高糖誘導(dǎo)小鼠足細胞凋亡的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-496組MPC5細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 上調(diào)miR-496對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞凋亡的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表5 上調(diào)miR-496對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞凋亡的影響

2.6 下調(diào)miR-496表達逆轉(zhuǎn)了100 μmol/L類葉升麻苷高糖誘導(dǎo)小鼠足細胞損傷作用 與HG+AS+anti-miR-NC組比較，HG+AS+anti-miR-496組MPC5細胞miR-496表達顯著降低，nephrin、podocin和Bcl-2蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 下調(diào)miR-496逆轉(zhuǎn)了類葉升麻苷高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞損傷的作用；A nephrin、podocin和凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 下調(diào)miR-496逆轉(zhuǎn)了類葉升麻苷高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞損傷的作用

3 討論

已有的研究顯示，類葉升麻苷主要存在于地黃屬、肉蓯蓉屬和連翹屬等植物中，除具有抗衰老、免疫增強、保肝、增強記憶力等作用外，在慢性腎炎、IgA腎病等泌尿系統(tǒng)疾病中具有保護作用[10,11]。然而，類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷是否具有保護作用仍有待證實。

nephrin和podocin是足細胞狹縫隔膜上的主要結(jié)構(gòu)成分，其緊密作用于足突的外膜，調(diào)節(jié)足細胞與基底膜之間的關(guān)系，在維持腎濾過屏障的完整性中起著重要作用[12]。上調(diào)podocin和nephrin蛋白可減少DN大鼠尿蛋白排泄率，緩解DN進展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)后MPC5細胞nephrin和podocin蛋白表達顯著降低，而類葉升麻苷處理呈劑量依賴效應(yīng)提高高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞中nephrin和podocin蛋白表達水平。與本研究結(jié)論類似，丁方睿等[14]證實類葉升麻苷通過恢復(fù)足細胞標記物nephrin表達，保護足細胞骨架，進而緩解嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細胞損傷。細胞凋亡是DN早期足細胞病理性丟失的重要原因。Bax和Bcl-2是參與細胞凋亡的兩個關(guān)鍵蛋白，其在包括在足細胞內(nèi)多種細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[15]。本研究顯示高糖誘導(dǎo)后MPC5細胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低，而類葉升麻苷處理呈劑量依賴效應(yīng)減輕高糖對MPC5的促凋亡作用。以上研究說明，類葉升麻苷處理對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷具有保護作用。

近年來，越來越多研究證實miRNA在調(diào)節(jié)足細胞的生理和病理發(fā)生中的潛在作用。Wu等[16]指出在嘌呤霉素氨基核苷處理的大鼠中，miR-30的缺失可誘導(dǎo)蛋白尿和足細胞損傷。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-770-5p表達可抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡和炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞中miR-496表達下調(diào)，通過轉(zhuǎn)染外源性miR-496 mimics上調(diào)miR-496表達能夠減輕高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡，并提高nephrin和podocin蛋白的表達水平，提示上調(diào)miR-496表達對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞損傷具有保護作用。與本研究結(jié)論類似，Yao等[18]證實上調(diào)miR-496還可降低腦缺血/再灌注損傷。類葉升麻苷處理后，高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞中miR-496的表達水平呈劑量依賴性顯著升高，提示類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞的保護作用可能與上調(diào)miR-496表達有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-496表達能夠逆轉(zhuǎn)類葉升麻苷對高糖對誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡、nephrin和podocin蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，這進一步說明類葉升麻苷通過上調(diào)miR-496表達對高糖對誘導(dǎo)的MPC5細胞損傷具有保護作用。

總之，本研究證實類葉升麻苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞損傷具有保護作用，其機制與上調(diào)miR-496表達有關(guān)，這為類葉升麻苷用于防治DN奠定了實驗基礎(chǔ)。