徐慧 文薏 林琳

動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制較為復(fù)雜。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷進行促使脂質(zhì)成分、炎性細胞在損傷部位浸潤進而形成粥樣斑塊，因而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷成為治療動脈粥樣硬化的重要措施[1,2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程，并可在動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3,4]。lncRNA HOXC-AS1在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細胞中表達下調(diào)，并可能參與細胞損傷過程[5]。但筆者發(fā)現(xiàn)lncRNA HOXC-AS1在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未可知。LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示lncRNA HOXC-AS1與miR-382-5p存在結(jié)合位點。研究表明miR-382-5p在脊髓損傷與小膠質(zhì)細胞損傷中表達上調(diào)，下調(diào)其表達可通過抑制炎性反應(yīng)從而減輕細胞損傷[6]。但lncRNA HOXC-AS1/miR-382-5p在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未闡明。因此，本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC建立動脈粥樣硬化模型，探討lncRNA HOXC-AS1是否可通過靶向調(diào)控miR-382-5p的表達而參與ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC購自上?？道噬?；ox-LDL購自美國Sigma；Trizol試劑、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑購自北京天根生化；pcDNA、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p、miR-NC、miR-382-5p mimics、si-NC、si-lncRNA HOXC-AS1購自廣州銳博生物；MTT、細胞凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶；雙熒光素酶報告基因載體購自美國Promega；IL-1β、IL-6、TNF-α檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；兔抗人Cleaved-caspase-3抗體與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:HUVEC細胞接種于96孔板(3×103個/孔)，用含有濃度為100 mg/L ox-LDL的DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[7]，記為ox-LDL組。同時將正常培養(yǎng)的HUVEC細胞記為NC組。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pcDNA、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-NC、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p mimics分別轉(zhuǎn)染至HUVEC細胞，轉(zhuǎn)染成功后用含有濃度為100 mg/L ox-LDL的DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為pcDNA+ox-LDL組、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+ox-LDL組、anti-miR-NC+ox-LDL組、anti-miR-382-5p+ox-LDL組、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-NC+ox-LDL組、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-382-5p+ox-LDL組。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期HUVEC細胞接種于96孔板(3×103個/孔)，用含有濃度為25、50、100 mg/L ox-LDL的DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，避光振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標儀檢測各孔吸光度值。

1.2.3 qRT-PCR檢測lncRNA HOXC-AS1、miR-382-5p的表達水平：采用Trizol試劑分別提取各組HUVEC細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄體系：5×g DNA Buffer 2 μl，10×King RT Buffer 2 μl，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μl，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μl，RNA(2 μg)，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μl；反應(yīng)條件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測基因相對表達量。

1.2.4 ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的水平：收集各組HUVEC細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:用胰蛋白酶消化各組HUVEC細胞制備單細胞懸液(5×105個/ml)，取1 ml細胞懸液經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌，加入400 μl結(jié)合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNA HOXC-AS1與miR-382-5p的靶向關(guān)系:lncRNA HOXC-AS1與miR-382-5p的結(jié)合位點克隆至pGL3質(zhì)粒中構(gòu)建野生型載體lncRNA HOXC-AS1-WT，點突變試劑盒將結(jié)合位點進行突變后克隆至pGL3質(zhì)粒中構(gòu)建突變型載體lncRNA HOXC-AS1-MUT，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述載體分別與miR-NC或miR-382-5p mimics共轉(zhuǎn)染至HUVEC細胞，培養(yǎng)48 h后用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達量:收集各組HUVEC細胞加入500 μl RIPA裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶800稀釋的Cleaved-caspase-3一抗與1∶1 000稀釋的內(nèi)參β-actin抗體后4℃孵育過夜，加入1∶3 000稀釋的二抗后37℃孵育2 h，應(yīng)用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ox-LDL對HUVEC細胞活性的影響 與NC組比較，25 mg/L ox-LDL組、50 mg/Lox-LDL組、100 mg/L ox-LDL組細胞活力降低(P<0.05)，其中ox-LDL濃度為100 mg/L時細胞活力相對較低，因而選用100 mg/L ox-LDL進行后續(xù)實驗。見表1。

表1 不同濃度ox-LDL對HUVEC細胞活性的影響

2.2 經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC細胞中，lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p表達情況 與NC組比較，ox-LDL組lncRNA HOXC-AS1的表達量降低(P<0.05)，miR-382-5p的表達量升高(P<0.05)。見表2。

表2 經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC細胞中，lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p表達情況

2.3 pcDNA-lncRNA HOXC-AS1抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和炎性反應(yīng) 與NC組比較，ox-LDL組IL-1β、IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；與pcDNA+ox-LDL組比較，pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+ox-LDL組IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 pcDNA-lncRNA HOXC-AS1抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和相關(guān)蛋白表達；A Western Blot檢Cleaved-caspase-3蛋白的表達；B 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表3 pcDNA-lncRNA HOXC-AS1抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和炎性反應(yīng)

2.4 anti-miR-382-5p抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和炎性反應(yīng) 與anti-miR-NC+ox-LDL組比較，anti-miR-382-5p+ox-LDL組IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 anti-miR-382-5p抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和炎性反應(yīng)

圖2 anti-miR-382-5p抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和相關(guān)蛋白表達；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.5 lncRNA HOXC-AS1靶向miR-382-5p，調(diào)控miR-382-5p的表達 lncRNA HOXC-AS1與miR-382-5p存在結(jié)合位點。miR-382-5p過表達可抑制野生型載體lncRNA HOXC-AS1-WT的熒光素酶活性(P<0.05)。lncRNA HOXC-AS1可靶向結(jié)合miR-382-5p。與pcDNA組比較，pcDNA-lncRNA HOXC-AS1組miR-382-5p的表達量降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-lncRNA HOXC-AS1組miR-382-5p的表達量升高(P<0.05)。見圖3，表5、6。

圖3 LncBase Predicted v.2對miR-382-5p和lncRNA HOXC-AS1結(jié)合進行預(yù)測

表5 雙熒光素酶活性檢測

表6 qRT-PCR檢測miR-382-5p 的表達

2.6 miR-382-5p可以逆轉(zhuǎn)pcDNA-lncRNA HOXC-AS1對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響 與pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-NC+ox-LDL組比較，pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-382-5p+ox-LDL組IL-1β、IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。見圖4，表7。

圖4 miR-382-5p可以逆轉(zhuǎn)pcDNA-lncRNA HOXC-AS1對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和相關(guān)蛋白表達；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表7 miR-382-5p可以逆轉(zhuǎn)pcDNA-lncRNA HOXC-AS1對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響

3 討論

ox-LDL促使血管內(nèi)皮細胞損傷是造成動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的重要原因，炎性反應(yīng)與脂質(zhì)沉積均可能引起血管內(nèi)皮細胞損傷[8]。lncRNA在腫瘤、炎癥性疾病等多種疾病中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可通過充當miRNA競爭性內(nèi)源RNA分子而調(diào)節(jié)其靶基因表達進而參與動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展過程[9,10]。

筆者發(fā)現(xiàn)目前l(fā)ncRNA HOXC-AS1在ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中的表達尚未可知。既往研究顯示，lncRNA HOXC-AS1在胃癌中表達上調(diào)，并可促進胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[11,12]。本研究數(shù)據(jù)顯示，ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中l(wèi)ncRNA HOXC-AS1的表達量降低，提示lncRNA HOXC-AS1可能參與動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平升高，與既往相關(guān)研究報道結(jié)果[13]相似，提示成功建立動脈粥樣硬化模型。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)lncRNA HOXC-AS1表達可降低ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，提示lncRNA HOXC-AS1過表達可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)。炎性反應(yīng)加劇可進一步促使細胞凋亡，本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高，與既往研究報道結(jié)果[14]相似，上調(diào)lncRNA HOXC-AS1表達可降低ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平，提示lncRNA HOXC-AS1過表達可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡。

本研究初步證實lncRNA HOXC-AS1序列上含有miR-382-5p的反應(yīng)元件，lncRNA HOXC-AS1可競爭性結(jié)合miR-382-5p。研究表明miR-382-5p在急性肺損傷[15]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[16]、嬰兒血管瘤[17]等多種疾病中表達異常，并可調(diào)節(jié)細胞增殖及凋亡。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中miR-382-5p的表達量升高，抑制miR-382-5p表達可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)及細胞凋亡，而上調(diào)其表達可逆轉(zhuǎn)lncRNA HOXC-AS1過表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)及細胞凋亡的抑制作用。提示lncRNA HOXC-AS1可通過靶向調(diào)控miR-382-5p表達而參與動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述，ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中l(wèi)ncRNA HOXC-AS1表達下調(diào)，miR-382-5p表達上調(diào)，lncRNA HOXC-AS1可靶向結(jié)合miR-382-5p，lncRNA HOXC-AS1過表達可通過抑制miR-382-5p表達而抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)及細胞凋亡從而減輕細胞損傷，為明確lncRNA HOXC-AS1在動脈粥樣硬化中的作用奠定實驗基礎(chǔ)，還可為動脈粥樣硬化性心血管疾病的預(yù)防及治療提供新方向。但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。