尹雪，焦陽，梅桂雪，徐興燕，譚樂俊，林永強(qiáng)

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評價重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101)

腦立清系列制劑包括丸劑、膠囊劑和片劑3個制劑規(guī)格，處方組成一致，僅在制劑工藝上有所區(qū)別，處方由磁石、赭石、珍珠母和冰片等十味藥組成，具有平肝潛陽，醒腦安神的功效[1]。處方中冰片具有開竅醒腦、清熱止痛之功效。冰片又稱合成龍腦，主要是由樟腦、松節(jié)油等經(jīng)化學(xué)方法合成，冰片在合成過程中會產(chǎn)生或殘留一定量的樟腦,另外，由于冰片的不穩(wěn)定性，在不得當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下，也會部分轉(zhuǎn)化為樟腦[3-9]。內(nèi)服樟腦會對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用，且有實驗表明長時間攝入樟腦，其在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝物蓄積也會產(chǎn)生一系列毒副作用[10]。因樟腦外觀和氣味與冰片相近，現(xiàn)在更有甚者人為的摻雜樟腦,給制劑帶來安全性風(fēng)險。

樟腦的檢查對冰片藥材具有重要的意義，已作為檢查指標(biāo)收入《中國藥典》2020年版冰片藥材的檢查項下[1]。但是含冰片的制劑中尚未規(guī)定樟腦限量的檢查。本課題組以樟腦為指標(biāo)成分，對腦立清制劑中的冰片投料情況進(jìn)行了研究。建立了腦立清丸(膠囊、片)中樟腦的氣相色譜(GC)檢查法，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法對陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)。

1 儀器與材料

儀器：Sartorius CP225D電子天平；Agilent 7890氣相色譜儀；島津GCMS-TQ8050 NX氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

試劑：乙酸乙酯、無水乙醇、乙醇均為色譜純。

對照品：樟腦(北京曼哈格生物科技有限公司，批號：C0007316，純度：99.9%)。

樣品：腦立清系列制劑為2020年國家藥品評價性抽驗樣品，涉及15家生產(chǎn)企業(yè)、88個生產(chǎn)批次(包括丸劑52批，膠囊劑34批，片劑2批)。

2 方法與結(jié)果

2.1 氣相色譜條件 以Agilent HP INNOWAX(柱長：30 m，內(nèi)徑：0.32 mm，膜厚：0.25 μm)為色譜柱；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；柱溫為140 ℃；檢測器溫度為250 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取樟腦對照品15.18 mg,置50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，即得樟腦對照品溶液(濃度為0.303 3 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 腦立清丸(膠囊、片)中均以冰片原粉入藥，處方中冰片所占比例為3.125%，根據(jù)《中國藥典》2020年版(一部)冰片藥材項下樟腦檢查項的取樣量計算，確定腦立清丸(膠囊、片)取樣量4.8 g，最終確定供試品溶液制備方法：取腦立清丸(膠囊、片)，研細(xì)，取4.8 g(相當(dāng)于冰片0.15 g)，置錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯10 mL ，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中除冰片以外的其他藥味，照處方的組成和比例制成不加冰片的陰性對照樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制得不含樟腦及冰片的腦立清陰性對照溶液。

2.2.4 陽性對照溶液的制備 取腦立清陰性對照樣品4.65 g和含2%樟腦的冰片0.15 g作為腦立清陽性對照，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制得含樟腦的腦立清陽性對照溶液。

分別取上述對照品、供試品、陰性對照、陽性對照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對照未檢出樟腦，陽性對照檢出樟腦，說明腦立清制劑中其他藥味對樟腦測定無干擾，該方法專屬性良好。氣相色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察 稱取樟腦對照品207.30 mg,置50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樟腦貯備溶液(C濃度=4.141 9 mg·mL-1)。分別精密量取不同體積樟腦貯備溶液配置成濃度為0.010 4、0.051 8、0.103 0、0.517 7、1.035 5、2.071 0、4.141 9 mg·mL-1的樟腦系列對照品溶液，精密吸取上述系列對照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，測定。以樟腦峰面積值為縱坐標(biāo)，以樟腦濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果可見，樟腦濃度在0.010 4～4.141 9 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，回歸方程Y=875.485 762X-4.385 286,r=0.999 98。

2.4 精密度試驗 吸取濃度為0.303 3 mg·mL-1的樟腦對照品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定。記錄峰面積分別為244.6、242.5、243.1、244.3、242.4、241.1，均值為243，RSD為0.54%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 取含樟腦的腦立清陽性樣品(編號：N03)，照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，平行制備6份。精密吸取上述供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測定。計算含量分別為1.78%、1.79%、1.78%、1.80%、1.79%、1.82%，均值為1.79%，RSD為0.73%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗 供試品溶液的制備：取已測知含量的含樟腦的腦立清陽性樣品(編號：N03)約4.8 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入樟腦對照品3 mg，照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，平行制備6份。分別精密吸取上述供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。試驗結(jié)果表明，測定方法的回收率良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取重復(fù)性考察項下供試品溶液，分別于制備后0、3、6、12、18、24 h進(jìn)樣測定。記錄峰面積分別為262.1、260.0、262.8、267.3、271.4、272.4，均值為266，RSD為1.94%。結(jié)果表明，樟腦在 24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可以滿足檢測需要。

2.8 檢測限和定量限 分別配制一個較低濃度的樟腦對照品溶液，注入氣相色譜儀，觀察其信噪比值(S/N)，當(dāng)S/N等于3時，此時的進(jìn)樣量為檢測限(LOD)，當(dāng)S/N等于10時，此時的進(jìn)樣量為定量限(LOQ)。樟腦的LOD為0.52 ng，LOQ為1.04 ng。

2.9 陽性樣品的氣-質(zhì)聯(lián)用驗證 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，對88批次腦立清樣品中檢測出樟腦的陽性樣品進(jìn)一步確證。

色譜條件：同“2.1”項下的色譜條件。

質(zhì)譜條件：檢測器為三重四級桿檢測器，檢測器電壓：0.1 kV；離子源為電子轟擊源(EI)，離子源溫度：200 ℃；質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃；質(zhì)譜檢測模式為：Q3Scan。

A.樟腦對照品；B.陽性對照；C.陰性對照圖1 專屬性試驗

表1 加樣回收率考察結(jié)果

測定法：分別精密吸取氣相色譜檢查項下的樟腦對照品溶液、陽性對照溶液、陰性對照溶液和檢出樟腦的腦立清陽性樣品各1 μL，注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，進(jìn)行全掃描，記錄離子碎片，將其與NIST17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

2.10 計算方式與限度 《中國藥典》2020年版(一部)冰片藥材項下規(guī)定樟腦不得過0.50%，因冰片和樟腦為揮發(fā)性成分，腦立清丸劑、膠囊劑、片劑3種制劑制備工藝不同，在制備過程中揮發(fā)性成分是否采用包和工藝、干燥溫度、時間均會對腦立清制劑中揮發(fā)性成分的含量產(chǎn)生影響，為了更合理的檢測樟腦限度，首先測定腦立清制劑中冰片(龍腦+異龍腦+樟腦)含量，以樟腦含量/冰片含量×100%進(jìn)行計算，結(jié)果以不得過0.50%作為限度。

2.11 GC法樣品檢測結(jié)果 采用GC法對15家生產(chǎn)企業(yè)88個生產(chǎn)批次的腦立清樣品進(jìn)行篩查，結(jié)果10家企業(yè)72個生產(chǎn)批次樟腦殘留量超出限度，結(jié)果見表2。

表2 88批腦立清制劑中樟腦含量

2.12 GC-MS法驗證結(jié)果 采用GC-MS法對檢測到樟腦的陽性樣品進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果樟腦對照品溶液與陽性對照、陽性樣品中在相同保留時間出現(xiàn)了m/z為95、81、108、152等相同的離子碎片，并將其與數(shù)據(jù)庫中樟腦進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)完全匹配，陰性對照在與樟腦對照品保留時間一致的位置上未檢測到樟腦離子碎片，且與數(shù)據(jù)庫比對匹配不到樟腦離子碎片，該測定結(jié)果與氣相色譜方法結(jié)果一致。典型圖譜見圖2。

A.陽性對照;B.樟腦對照品;C.陰性對照圖2 GC-MS Q3Scan離子碎片圖

3 討論

3.1 提取因素的考察 采用單因素試驗對提取溶劑(乙酸乙酯、無水乙醇、乙醇)、提取方式(超聲處理、渦旋震蕩、靜置方式)、提取時間(5、10、15、30 min)、提取溶劑用量(5、10、20 mL)進(jìn)行考察，最終確定精密加入乙酸乙酯10 mL，超聲提取10 min為最佳提取方案。

3.2 定量方法考察 分別采用內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法制備腦立清樣品溶液，注入氣相色譜儀測定，結(jié)果內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法測定樟腦含量分別為2.35%、2.32%，結(jié)果可見，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測得的樟腦含量無明顯差別，表明本試驗所用儀器靈敏度高，因此選用外標(biāo)法進(jìn)行測定。

3.3 檢測結(jié)果的分析 對15家生產(chǎn)企業(yè)88個生產(chǎn)批次的腦立清樣品進(jìn)行篩查，結(jié)果10家企業(yè)72個生產(chǎn)批次樟腦殘留量超出限度，最高者可達(dá)1.78%，問題批次占全部批次的81.8%。針對多批次制劑中存在樟腦超限的現(xiàn)象可能存在的原因進(jìn)行分析：①冰片原料質(zhì)控不嚴(yán)，冰片藥材本身樟腦超限；②原料存儲方式不當(dāng)，導(dǎo)致冰片中部分龍腦氧化為樟腦；③丸劑的檢出率高于膠囊劑，推測丸劑生產(chǎn)中，40 ℃干燥過程加速了龍腦氧化為樟腦的速度，各企業(yè)干燥時長差別較大，2 h到9 h不等，對冰片中龍腦的穩(wěn)定性影響較大。建議企業(yè)加強(qiáng)冰片原料管控，優(yōu)化工藝；通過建立腦立清制劑中樟腦限量標(biāo)準(zhǔn)或補(bǔ)充檢驗方法檢查項，對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)做有益補(bǔ)充，以保證廣大人民群眾用藥安全。