李瑞，陳穎，陳迅，張自強(qiáng)

(南京斯泰爾醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 南京 210046)

黃體酮(progesterone)又名孕酮，是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激素，是目前臨床黃體支持的首選藥物[1]。內(nèi)源性黃體酮可使子宮內(nèi)膜從增生期轉(zhuǎn)化為分泌期，從而促使子宮內(nèi)膜成熟、剝落并維持月經(jīng)周期。黃體酮制劑在臨床常用的適應(yīng)證有：黃體功能不全、預(yù)防早產(chǎn)、功能失調(diào)性子宮出血等。

常用的臨床給藥途徑有口服、注射、陰道給藥3種方式。黃體酮在體內(nèi)的含量很低(ng級(jí))，故采用傳統(tǒng)的高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)法很難準(zhǔn)確檢測(cè)其體內(nèi)的血藥濃度，臨床上常用的黃體酮含量測(cè)定多采用放射免疫法，但由于交叉免疫[2]反應(yīng)使得該方法極易受到體內(nèi)多種結(jié)構(gòu)相似的甾體類(lèi)激素影響，因此專(zhuān)屬性略顯不足。本文以醋酸甲地孕酮為內(nèi)標(biāo)物，血漿經(jīng)乙腈沉淀處理后進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析，建立了快速、靈敏、易操作的LC-MS/MS[3-7]方法，并將驗(yàn)證后的方法應(yīng)用于比較3種黃體酮制劑經(jīng)肌內(nèi)注射給藥后在雄性Beagle犬體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，可以為黃體酮制劑的后續(xù)臨床研究提供借鑒。

1 材料

1.1 藥品與試劑 黃體酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.7%，批號(hào)：100027-201209)；醋酸甲地孕酮(中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.2%，批號(hào)：1000171-201204)；黃體酮-油劑(浙江仙琚制藥股份有限公司，20 mg：1 mL，批號(hào):161102)；參比黃體酮-水劑(Prolutex，Marckyl Pharma，20 mg/0.9 mL，批號(hào)：26871)；黃體酮注射液(南京澤恒醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，20 mg：1 mL，批號(hào)：170824)；甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；甲酸為色譜級(jí)(Sigma Aldrich公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜(Agilent 1200)串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Agilent 6410)，配備ESI離子源，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：Mass Hunter Acquisition以及Mass Hunter Qualitative工作站；CPA225D電子天平(Sartorius公司)；超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Beagle犬6只，體重：7～9 kg，購(gòu)自北京瑪斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(京)2016-0001；合格證編號(hào)：11400600001897，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2016-0013。

2 方法

2.1 檢測(cè)條件 液相色譜條件：Zorbax SB-C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸∶甲醇(20∶80)，等度洗脫，流速0.4 mL·min-1，柱溫為20 ℃，分析時(shí)間為4 min；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI源)；正離子模式檢測(cè)；干燥器溫度：450 ℃；流量：12 L·min-1；噴霧壓力：45 Psi；毛細(xì)管電壓：3 500 V；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子檢測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定量，用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 315.3→97.1(黃體酮)，碎裂電壓：135 V，碰撞能量：18 V，內(nèi)標(biāo)物m/z 385.33→267.2(醋酸甲地孕酮)，碎裂電壓：135 V，碰撞能量：18 V。

2.2 溶液的配制

2.2.1 黃體酮對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取黃體酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成黃體酮貯備液，濃度為1 mg·mL-1，用前用50%甲醇定量稀釋制成系列濃度的對(duì)照品溶液(10、20、50、100、500、1 000、5 000、10 000、20 000 ng·mL-1)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 醋酸甲地孕酮內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取醋酸甲地孕酮對(duì)照品適量，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度約為50 ng·mL-1的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 給藥與血樣采集 6只雄性Beagle犬隨機(jī)分為兩組，分別編為A、B兩組，采用單劑量三周期交叉給藥。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)階段，第一階段A組給予受試制劑，B組給予參比制劑-油劑；第二階段A組給予參比制劑-油劑，B組給予受試制劑；第三階段A組給予參比制劑-水劑，B組給予參比制劑-水劑。各階段時(shí)間間隔為7 d，每一階段給藥劑量均為20 mg的黃體酮制劑。

每次實(shí)驗(yàn)前雄性Beagle犬需禁食12 h(取下喂食的食盒)，自由飲水，第二天肌內(nèi)注射受試制劑和參比制劑，給藥3 h后正常給水和食物。采血時(shí)間分別是給藥前1 h、0.5 h、0 h和給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h，采集靜脈血樣1 mL至加有EDTA-2K+抗凝的采血管，于冰上暫存至離心，全血經(jīng)8 000 r·min-1離心5 min后收集血漿，轉(zhuǎn)移血漿至96孔板中，于-20 ℃保存待測(cè)。

2.4 血漿樣品處理 取血漿50 μL，加入含有內(nèi)標(biāo)的200 μL乙腈沉淀后振蕩5 min，4 000 r·min-1離心(4 ℃)10 min，取150 μL上清液轉(zhuǎn)移至已加入50 μL純水的干凈96孔板中，渦旋混勻后放入自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)樣(5 μL)進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用軟件Phoenix WinNonlin 8.0的非房室模型分析方法對(duì)測(cè)得的雄性Beagle犬給予3種黃體酮制劑后的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算，計(jì)算3種黃體酮制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。描述性統(tǒng)計(jì)量包括平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，通過(guò)Tmax、Cmax和AUCINF_obs評(píng)價(jià)受試制劑與兩種參比黃體酮制劑的差異。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白血漿、空白血漿加對(duì)照品以及Beagle犬給藥后血漿樣本，按“2.4”項(xiàng)下加內(nèi)標(biāo)處理后，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，黃體酮保留時(shí)間為2.1 min，醋酸甲地孕酮保留時(shí)間為1.9 min。血漿中的內(nèi)源性成分不干擾黃體酮和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，峰形和分離度均良好(見(jiàn)圖1)。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限試驗(yàn) 取空白雄性Beagle犬血漿450 μL，分別加入不同濃度的黃體酮對(duì)照品溶液50 μL，制備系列濃度血漿樣品，即1、2、5、10、50、100、500、1 000、2 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿，平行兩份。按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析。測(cè)得黃體酮峰面積(A)及甲地孕酮峰面積(B)。以黃體酮峰面積對(duì)甲地孕酮峰面積平均值的比值(A/B)對(duì)黃體酮的血藥濃度(X)作回歸方程計(jì)算，測(cè)得回歸方程：Y=0.000 535 9X-0.000 023 58(r=0.996 1)，線性范圍為1～2 000 ng·mL-1，定量下限為1 ng·mL-1(S/N>10)。

圖1 血漿中典型黃體酮以及內(nèi)標(biāo)的典型MRM色譜圖

3.1.3 殘留效應(yīng)試驗(yàn) 在分析標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度2 000 ng·mL-1血漿樣品后，進(jìn)樣空白溶劑以考察殘留效應(yīng)，在待測(cè)物的出峰位置未出現(xiàn)明顯干擾峰，表明高濃度樣品不會(huì)影響隨后的低濃度樣品測(cè)定。

3.1.4 提取回收率與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取空白血漿450 μL，精密加入不同濃度的黃體酮標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，制備低、中、高(2、100、1 600 ng·mL-1)的血漿，每種濃度各做5份樣品。按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，黃體酮A1和甲地孕酮B1；另配相應(yīng)濃度的對(duì)照品進(jìn)樣得峰面積A2和B2，提取回收率(%)=A1/A2×100%；將A1/B1帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，按照準(zhǔn)確度(%)=測(cè)得量/添加量×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血漿中黃體酮提取回收率和準(zhǔn)確度

結(jié)果表明，提取回收率和準(zhǔn)確度RSD均≤15%，符合生物樣本測(cè)試的要求。

3.1.5 精密度試驗(yàn) 制備低、中、高3個(gè)濃度的血漿質(zhì)控樣品(2、100、1 600 ng·mL-1)各5份，在日內(nèi)和日間(連續(xù)測(cè)定3 d)進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，代入當(dāng)天隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃體酮的濃度，評(píng)估日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果表明，日內(nèi)和日間精密度RSD均≤15%，符合生物樣本測(cè)試的要求。

3.1.6 基質(zhì)效應(yīng) 分別取6只Beagle犬的空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，制備不加對(duì)照和內(nèi)標(biāo)的上清液，然后以此上清液制備相應(yīng)濃度的低、中、高濃度血漿樣品，進(jìn)樣分析，記錄峰面積(A)，同時(shí)用流動(dòng)相配制低、中、高3個(gè)濃度的樣品(加內(nèi)標(biāo))，得峰面積(B)，基質(zhì)效應(yīng)=A/B×100%。黃體酮低、中、高3個(gè)質(zhì)控濃度的血漿樣品基質(zhì)效應(yīng)分別為94.21%±5.30%、101.24%±3.55%、96.12%±4.64%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為93.74%±3.67%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下黃體酮的測(cè)定不受基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

3.1.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白血漿450 μL，精密加入黃體酮對(duì)照品溶液50 μL，制備濃度為50 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣本進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，反復(fù)凍、融3次后處理并測(cè)定，RSD為5.32%，-20 ℃凍存，分別于0、1、5、10、15 d測(cè)定，RSD為4.77%；室溫放置8 h，分別于0、2、4、8 h測(cè)定，RSD為4.09%，自動(dòng)進(jìn)樣器放置12 h，分別于0、2、4、8、12 h測(cè)定，RSD為2.96%。血漿樣品在各條件下均穩(wěn)定。

3.2 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 分別給出6只雄性Beagle犬血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)及曲線和每組平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及曲線，比較受試和參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)差異。

采用軟件Phoenix WinNonlin 8.0的非房室模型計(jì)算犬給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。達(dá)峰濃度Cmax：采用實(shí)測(cè)值；達(dá)峰時(shí)間Tmax：采用實(shí)測(cè)值；藥時(shí)曲線下面積AUC0～t值：采用梯形法計(jì)算；AUC0～∞=AUC0～t+Ct/ke，Ct為最后一個(gè)可測(cè)得時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，ke為消除速率常數(shù)；AUMC：藥物與時(shí)間乘積對(duì)時(shí)間t的積分；平均滯留時(shí)間MRT=AUMC/AUC。

給藥前藥物濃度如果能夠檢出，則將給藥前三個(gè)時(shí)間點(diǎn)藥物濃度取平均值，采用給藥后實(shí)測(cè)藥物濃度減去給藥前藥物濃度平均值的方法得到給藥后的藥物濃度，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3.3 結(jié)果分析 采用Phoenix WinNonlin 8.0軟件，按統(tǒng)計(jì)矩理論分別求算犬給予3種黃體酮制劑后各只犬的相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，詳見(jiàn)表2。

經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，受試制劑與參比黃體酮-油劑的AUCINF_obs無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但與參比黃體酮水劑有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。受試制劑與參比黃體酮油劑的Cmax有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，與參比黃體酮-水劑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

4 討論

本文建立了LC-MS/MS法檢測(cè)了犬血漿中黃體酮的血藥濃度，本法耗時(shí)短、準(zhǔn)確度好、靈敏度高；并能有效地應(yīng)用于對(duì)3種黃體酮制劑的藥動(dòng)學(xué)考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在黃體酮血漿濃度為1～2 000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.996 1)。日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)的RSD均小于15%，方法回收率為85%～115%，定量下限為1 ng·mL-1。本方法穩(wěn)定，符合生物樣品方法驗(yàn)證要求[7]。

表2 雄性Beagle犬肌內(nèi)注射給予3種黃體酮制劑后血漿中黃體酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

注意：*表示2A3犬給藥二次，該動(dòng)物未用于計(jì)算平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)；3A2犬的T1/2確定為異常值，可能由于測(cè)樣的操作失誤導(dǎo)致

通過(guò)雄性Beagle犬三周期分別單次肌內(nèi)注射給予20 mg/只受試黃體酮注射液、參比黃體酮-油劑、參比黃體酮-水劑后血藥動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果可知，犬體內(nèi)黃體酮的達(dá)峰時(shí)間Tmax分別為(0.19±0.09)h、(1.50±1.40)h和(0.14±0.09)h；Cmax分別為(721.64±238.71)、(104.14±56.70)和(607.83±121.96)ng·mL-1；3種制劑的AUCINF_obs分別為(629.34±169.90)、(796.16±226.16)和(766.27±147.09)h·ng·mL-1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，受試制劑與參比黃體酮-油劑的AUCINF_obs無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但與參比黃體酮水劑有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。受試制劑與參比黃體酮油劑的Cmax有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，與參比黃體酮-水劑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，本預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為后續(xù)黃體酮注射液的臨床應(yīng)用動(dòng)力學(xué)研究提供了參考。