夏濤濤 ,蘇浩昌,胡曉娟,徐 煜,文國(guó)樑,曹煜成 , ,余招龍
1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306
2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510300
3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心,廣東 茂名 525400
抗生素的廣泛應(yīng)用及其在生物體內(nèi)的不完全代謝,使其容易殘留在自然環(huán)境中,這是造成抗生素抗性基因 (Antibiotic resistant genes, ARGs) 和抗性菌 (Antibiotic resistant bacteria, ARB) 產(chǎn)生的主要原因[1]。近年來(lái)ARGs作為新型污染物受到廣泛關(guān)注,它借助可移動(dòng)遺傳元件轉(zhuǎn)移到病原菌的基因組中,使其產(chǎn)生抗生素耐藥性,對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物乃至人體健康均造成潛在威脅[2-3]。ARGs在污水處理廠、禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng),以及其他一些自然水體環(huán)境中均曾被檢出[4-6],并且在部分水產(chǎn)品中磺胺類、四環(huán)素類和鏈霉素類的ARGs亦有檢出[7-8]。Su等[9]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水源水中的ARGs含量及種類數(shù)量均遠(yuǎn)高于養(yǎng)殖池塘水體,并且未經(jīng)處理的養(yǎng)殖尾水被重復(fù)利用也會(huì)導(dǎo)致ARGs在養(yǎng)殖環(huán)境中傳播[10];因此,從源頭上防控ARGs在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的傳播尤為重要。科學(xué)使用漁用氧化劑對(duì)池塘環(huán)境進(jìn)行消毒,可有效防治養(yǎng)殖病害,還可改善養(yǎng)殖環(huán)境[11]。含氯氧化劑因價(jià)格低廉、殺菌效果好在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用廣泛[12-13]。三氯異氰尿酸 (C3O3N3Cl3)俗稱強(qiáng)氯精,是養(yǎng)殖生產(chǎn)常用的含氯氧化劑之一,它的有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)90%,殺菌效果好,對(duì)水中大部分真菌、芽孢及病毒均具有殺滅作用[14]。
采用傳統(tǒng)的污水消毒工藝所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片中大多仍含有完整的DNA殘余物,這將會(huì)給下游細(xì)菌種群帶來(lái)ARGs[15]。因而,除了殺滅目標(biāo)微生物之外,還應(yīng)關(guān)注消毒技術(shù)對(duì)微生物DNA的破壞能力。活性氯、臭氧、紫外線或過(guò)渡金屬離子參與的高級(jí)氧化作用均可對(duì)ARGs產(chǎn)生較強(qiáng)的去除效果[10,16-18]。Yoon等[19]發(fā)現(xiàn)有效氯質(zhì)量濃度高于37 mg·L?1時(shí)對(duì)環(huán)境中的ARGs具有明顯的消除效果??梢?jiàn),科學(xué)應(yīng)用氧化消毒方法可有效消減養(yǎng)殖水環(huán)境中的ARGs進(jìn)而防控其傳播。
目前有關(guān)漁用氧化劑與氧化消毒處理對(duì)水環(huán)境中 ARGs 消除效果的研究報(bào)道較少。本研究選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的強(qiáng)氯精,分析其對(duì)近海水源水中常見(jiàn)ARGs的去除效果,探討從源頭上控制ARGs在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中傳播的可行性,為進(jìn)一步建立養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量安全控制技術(shù)提供參考。
TB Green Real Time qPCR Kit 購(gòu)自 TaKaRa 公司,F(xiàn)astDNATMSPIN Kit for Soil購(gòu)自MQBIO公司,實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的主要儀器包括熒光定量 PCR 儀 qTOWER3 (Analytikjena,德國(guó)),冷凍離心機(jī) (Sigma,德國(guó)),恒溫金屬浴鍋 (上海一恒),研磨儀 (上海凈信)。
1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與樣品采集
實(shí)驗(yàn)在廣東省茂名市電白區(qū)廣東冠利達(dá)海洋生物有限公司養(yǎng)殖基地開(kāi)展。根據(jù)水樣來(lái)源實(shí)驗(yàn)分為近海水源水 (SY組)、蓄水沉淀池水體 (XSC組)、氧化消毒處理后的養(yǎng)殖備用水 (XD組) 3組。其中,SY組的水體取自茂名電白雞打港閘口,XSC組水體取自養(yǎng)殖場(chǎng)的蓄水沉淀池,XD組水體取自養(yǎng)殖場(chǎng)棚內(nèi)的消毒池。2021年5月31日對(duì)養(yǎng)殖備用水進(jìn)行消毒處理,消毒水體為500 m3,水體中消毒劑強(qiáng)氯精的質(zhì)量濃度為40 mg·L?1;添加消毒劑后的第二天開(kāi)始取樣,此時(shí)氧化劑基本溶解;實(shí)驗(yàn)期間蓄水池和消毒處理后的養(yǎng)殖備用水不進(jìn)行換水操作,盡量維持實(shí)驗(yàn)環(huán)境穩(wěn)定。水樣采集時(shí)間為2021年6月1、15和29日的9:00—10:00 (該地區(qū)6月13日左右有過(guò)降雨),每隔14 d取樣1次,分別對(duì)以上3處水體進(jìn)行3次采樣。使用 3 L 有機(jī)玻璃采水器在距離水面30 cm 處采集水樣,每個(gè)采樣點(diǎn)包括3個(gè)不同位置的取水點(diǎn),每隔20 m分別采樣,將每個(gè)采樣點(diǎn)的水樣注入20 L的聚乙烯桶內(nèi)充分混合后分裝到1 L的聚乙烯樣品瓶?jī)?nèi),低溫保存并帶回實(shí)驗(yàn)室。取200 mL水樣經(jīng)0.22 μm 孔徑的無(wú)菌濾膜過(guò)濾,獲得的濾膜置于無(wú)菌封口袋內(nèi)?80 ℃保存。3次采集的水體樣品分別命名為水源水 SY1、SY2、SY3,蓄水沉淀池水體 XSC1、XSC2、XSC3,消毒后池塘養(yǎng)殖備用水 XD1、XD2、XD3。
1.2.2 總DNA的提取
無(wú)菌條件下將濾膜剪碎,使用土壤 DNA 提取試劑盒 FastDNATMSPIN Kit for Soil并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟對(duì)水樣中的總 DNA 進(jìn)行提取與純化。提取的總 DNA 使用 NanoDrop 2000 進(jìn)行純度檢測(cè),要求 260/280介于1.8~1.9。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
將克隆有目標(biāo)抗性基因的大腸桿菌 (Escherichia coli) 標(biāo)準(zhǔn)菌株SFEC1, 37 ℃培養(yǎng) 20 h 后使用天根質(zhì)粒提取試劑盒 (上海) 提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,并于NanoDrop 2000下測(cè)定濃度及純度后,計(jì)算出目的基因拷貝數(shù),使用超純水對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,設(shè)定7個(gè)濃度梯度,進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定,根據(jù)回歸系數(shù)R2、擴(kuò)增效率及溶解曲線確定擴(kuò)增良好性及特異性。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)lg copies為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,要求標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足以下條件:R2>0.99,擴(kuò)增效率介于 90%~110%。分裝后?20 ℃保存。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SFEC1由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所提供。
1.3.2 水樣的RT-qPCR定量檢測(cè)
監(jiān)測(cè)的目標(biāo)ARGs共7種,包括2種磺胺類抗性基因 (sul1和sul2),2種氯霉素類抗性基因(cmlA和floR),1種喹諾酮類抗性基因 (qnrA) 和2種四環(huán)素類抗性基因 (tetW和tetX)。樣品qPCR檢測(cè)使用 TB Green Real Time qPCR Kit 在qTOWER3熒光定量 PCR 儀上完成。qPCR的反應(yīng)體系為10 μL,各組分加樣量見(jiàn)表1。反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性 30 s;95 ℃ 變性15 s,退火 20 s,72 ℃延伸30 s,40 個(gè)循環(huán)。按qTOWER3 PCR儀默認(rèn)熔解曲線程序進(jìn)行溶解曲線分析。各目的基因引物序列及退火溫度見(jiàn)表2。
表1 qPCR 反應(yīng)體系Table 1 qPCR reaction solution
表2 本研究中qPCR 所需引物Table 2 Primers used for quantitative PCR in this study
文中的對(duì)數(shù)取值時(shí)底數(shù)為10,濃度降低量為lg(C0·C?1),其中 C0表示處理前水源水中 ARGs濃度;C表示處理后水體中ARGs濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 軟件處理,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并使用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)差異,顯著性水平設(shè)為P<0.05。
如表3所示,水樣中SS和COD的質(zhì)量濃度最高,其在水源水中的質(zhì)量濃度分別為9~36 mg·L?1和9.2~22.2 mg·L?1,經(jīng)沉淀處理后分別降至2~12 mg·L?1和 2.9~4.9 mg·L?1,氧化處理后分別降至2~6 mg·L?1和≤0.8 mg·L?1。其他水質(zhì)因子在各水樣中始終保持在較低水平。
在所有檢測(cè)的樣品中sul1、sul2、floR 和 tetX等ARGs的Ct值較小 (表4),表明其在樣品中的含量較高,為樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)ARGs,因而將它們作為目標(biāo)ARGs用于后續(xù)分析比較沉淀及氧化處理前后不同樣品中ARGs的變化情況。
表4 樣品中ARGs的Ct值檢測(cè)結(jié)果Table 4 Ct value of ARGs in samples
水源水中ARGs濃度最高為2.3×107~4.7×107copies·mL?1,其次為蓄水沉淀池水體 (2.1×106~1.1×107copies·mL?1),最低為氧化消毒水體 (6.7×105~1.2×106copies·mL?1,圖 1)。
圖1 各樣品中ARGs總濃度變化注:不同字母代表顯著差異 (P<0.05)。Fig. 1 Total ARGs concentrations in samplesNote: Different letters indicate significant difference (P<0.05).
如圖2所示,在所檢測(cè)樣品中sul1、sul2、floR和tetX 4種ARGs的濃度較高,且各個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的樣品中以上4種ARGs均被檢出。其中,sul2 的濃度為 6.6×105~4.1×107copies·mL?1,sul1 為3.0×103~2.2×105copies·mL?1,tetX 為 7.4×101~2.0×104copies·mL?1,floR 為 1.4×101~1.5×102copies·mL?1。
圖2 不同時(shí)刻相同采樣點(diǎn)各種優(yōu)勢(shì)ARGs的濃度Fig. 2 Concentrations of various dominant ARGs at same sampling point at different time
對(duì)比同一取樣點(diǎn)的3次取樣可知水源水和蓄水沉淀池水體中ARGs濃度隨時(shí)間變化較大(圖3),其濃度范圍分別介于2.3×107~4.7×107copies·mL?1和 2.1×106~1.1×107copies·mL?1。氧化消毒水體中ARGs濃度維持在較低水平,3次取樣的ARGs總濃度隨時(shí)間變化不明顯,分別為3.5×107、5.0×107和 4.7×107copies·mL?1。
圖3 3次取樣時(shí)ARGs總濃度對(duì)比Fig. 3 Comparison of total ARGs concentrations for three samplings
蓄水池水經(jīng)沉淀處理后的水樣和氧化消毒處理后水體中sul2的濃度分別較水源水下降了3.1×107和 3.6×107copies·mL?1,去除效果為 0.86 lg (P<0.05) 和1.58 lg (P<0.05)。其中氧化消毒對(duì)水體中sul1和tetX去除能力較強(qiáng),分別達(dá)到0.94 lg (P<0.05) 和1.30 lg (P<0.05)。各水樣中sul2的濃度高出floR、sul1和tetX幾個(gè)數(shù)量級(jí),sul2濃度與水樣中總ARGs的濃度接近,水樣中總ARGs的濃度下降程度與sul2在水樣中的濃度變化相近。
在自然水體環(huán)境中ARB是ARGs的主要傳播介質(zhì),細(xì)胞內(nèi)的ARGs濃度要遠(yuǎn)高于細(xì)胞外[24],養(yǎng)殖水環(huán)境中ARGs的去除主要針對(duì)胞內(nèi)。Su等[9]研究發(fā)現(xiàn),在養(yǎng)殖期間水樣中ARGs濃度呈下降趨勢(shì),水源水中ARGs總濃度顯著高于蝦池。本結(jié)果顯示近海水源水中ARGs的濃度遠(yuǎn)高于蓄水池水體,表明養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs主要來(lái)自養(yǎng)殖水源水。而Wang等[25]的研究結(jié)果卻顯示蝦池水中ARGs總濃度高于水源水和養(yǎng)殖尾水。可能由于該池養(yǎng)殖年限久導(dǎo)致ARGs在池塘沉積物中累積,又因未對(duì)沉積物進(jìn)行氧化消毒處理,致使沉積物中的ARGs不斷遷移到養(yǎng)殖水環(huán)境中,因而被大量檢出。
該養(yǎng)殖用水中主要的ARGs是磺胺類,其中在近海水源水中sul2濃度介于2.3×107~4.7×107copies·mL?1(圖2),有研究表明,磺胺類藥物的廣泛使用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中各種細(xì)菌對(duì)磺胺類抗生素的抗性顯著增加[26],說(shuō)明該地區(qū)歷史上常用的抗生素可能是磺胺類藥物。Luo等[27]對(duì)海河中ARGs的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)sul2水平顯著高于sul3和四環(huán)素類等其他種類。在關(guān)于珠江水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境ARGs 的研究中,同樣發(fā)現(xiàn)磺胺類 ARGs 在養(yǎng)殖水體和沉積物中普遍存在,且檢出率和水平均高于其他種類[28]。上述結(jié)果與本研究結(jié)果一致,說(shuō)明磺胺類的宿主菌對(duì)這些環(huán)境的耐受能力強(qiáng),有利于這類基因在環(huán)境中的廣泛傳播。
圖3顯示,對(duì)比同一取樣點(diǎn)3次采樣的ARGs,水源水和蓄水沉淀池水體中ARGs的濃度變化均較大。Liu等[29]的研究表明,在人為干擾少的環(huán)境中,ARGs在雨季的檢出濃度低于旱季,推測(cè)降雨可能會(huì)稀釋水環(huán)境中的ARGs。然而有研究顯示,生活污水等的排放不僅增加了地表水中抗生素的濃度,還會(huì)直接增加ARGs的濃度[30]。Ahmed等[31]和Li等[32]在對(duì)人類活動(dòng)頻繁的流域及城市排水系統(tǒng)等的研究中也發(fā)現(xiàn),雨季的水樣和沉積物樣品中ARGs的濃度和種類均高于旱季。推測(cè)雨季可能給ARB提供了適宜的增殖環(huán)境,同時(shí)雨水將積累在生活社區(qū)內(nèi)的ARGs及ARB輸入開(kāi)闊水域。本實(shí)驗(yàn)中的水源水位于開(kāi)放水域,且該水域受自然和人為活動(dòng)影響大,其水體中ARGs濃度的變化受多種因素影響。蓄水池水體屬于半開(kāi)放水體且面積較小,主要受天氣變化影響,且影響較大。在本次實(shí)驗(yàn)的采樣周期中遇到降雨,導(dǎo)致蓄水池中ARGs濃度明顯下降。而氧化消毒水體中ARGs濃度變化小,可能是由于該養(yǎng)殖備用水位于養(yǎng)殖大棚內(nèi),因而不受外界環(huán)境變化影響。由此可知,養(yǎng)殖用水經(jīng)氧化處理后在無(wú)外界干擾時(shí),環(huán)境中的ARGs可以維持在低濃度且相對(duì)穩(wěn)定的水平。
沉淀處理后的水體中總ARGs濃度與近海水源水相比下降了0.86 lg,其中floR下降了0.34 lg,sul1下降了0.17 lg,sul2下降了0.86 lg,tetA下降了?0.32 lg (表5)。由于在該地區(qū)磺胺類抗性基因sul2是養(yǎng)殖水體中主要的ARGs,其濃度最高,且在沉淀處理后下降比例最大,因此沉淀處理對(duì)sul2的去除最明顯。養(yǎng)殖前期提前向蓄水池進(jìn)水,經(jīng)沉淀可有效降低水體中ARGs的濃度,這與Su等[33]和Wang等[25]的研究結(jié)果相似。其中,tetA的去除效果不明顯,根據(jù)Nolvak等[34]的研究結(jié)果顯示,可能是由于tetA在此環(huán)境中具有更廣的宿主范圍。此外,Huang等[35]的研究表明水體中ARGs含量降低主要是由水體中ARB向沉積物中遷移導(dǎo)致。養(yǎng)殖用水雖然可以經(jīng)蓄水池沉淀而降低水體中ARB和ARGs的含量,但同時(shí)也會(huì)造成沉積物中ARGs含量升高。同時(shí),沉積物與水體中的ARGs關(guān)聯(lián)性很強(qiáng),在高溫時(shí)會(huì)促進(jìn)ARB的繁殖和水力擾動(dòng)均會(huì)使ARGs進(jìn)入水體[36],因此需要開(kāi)發(fā)適合的技術(shù)方法來(lái)去除沉積物中的ARGs。
表5 沉淀及氧化處理對(duì)水體中ARGs去除量比較Table 5 Comparison of removal effects of ARGs in water by sedimentation and oxidation treatment lg
目前,關(guān)于氯制劑對(duì)海水水體中ARGs去除的相關(guān)研究較少,本研究旨在探究海水養(yǎng)殖中氯制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中ARGs的去除效果。由于氯制劑中的有效成分為次氯酸 (HClO) 和次氯酸根離子 (ClO?),其中HClO的氧化能力強(qiáng)于ClO?,pH會(huì)通過(guò)影響HClO的含量來(lái)影響氯制劑的氧化能力[37];因而,在海水養(yǎng)殖中應(yīng)考慮消毒后pH變化對(duì)后續(xù)養(yǎng)殖生產(chǎn)的可能影響。Stange等[38]的研究表明使用氯制劑30 min,可使ARGs減少0.8~2.8 lg,與本實(shí)驗(yàn)經(jīng)強(qiáng)氯精氧化消毒處理后水體中總的ARGs與蓄水池水體相比下降了0.72 lg的結(jié)果類似。據(jù)報(bào)道在低濃度的氯化作用下細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中的復(fù)制,增加存活細(xì)菌細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù),從而導(dǎo)致水中ARGs的相對(duì)豐度增加[39]。Sullivan等[40]的研究表明氯制劑可完全去除水體中的ARB,但無(wú)法完全除去ARGs,因而不能控制氧化處理后ARB的再生。有關(guān)氯制劑對(duì)水體中ARB攜帶ARGs的氧化去除作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
水環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)還原性物質(zhì)能與氧化劑發(fā)生反應(yīng),消耗氧化劑[41],在污水處理系統(tǒng)中上述還原性物質(zhì)的含量顯著影響水體中ARGs的氧化去除率[19]。本研究結(jié)果顯示水源水中的COD遠(yuǎn)高于經(jīng)沉淀池和氧化消毒池水體,表明在進(jìn)行氧化消毒處理時(shí)會(huì)由于水體中還原性物質(zhì)的存在而導(dǎo)致氧化劑的消耗。此外,Sharma等[42]的研究顯示氯制劑對(duì)鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶有更強(qiáng)的氧化作用,而對(duì)腺嘌呤和胞嘧啶的氧化作用較弱。本實(shí)驗(yàn)中,不同ARGs的去除效果不同,可能與各種ARGs中腺嘌呤和胞嘧啶的占比有關(guān)。此外,具有不同種類抗性基因的同類細(xì)菌對(duì)氯制劑的耐受程度也不同,如紅霉素抗性菌對(duì)氯有更強(qiáng)的耐受能力[37],可能與其抗性機(jī)制有關(guān)。由此可知,氯制劑對(duì)ARGs的去除作用有一定的局限性,因而,需要相關(guān)技術(shù)手段配合以達(dá)到最優(yōu)效果。Zhao 等[43]的研究表明,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中就氯制劑、溴制劑及高錳酸鉀等而言,氯制劑對(duì)ARGs的氧化去除效果最好,高錳酸鉀在水體中氧化效果更持久。本研究中所使用強(qiáng)氯精的質(zhì)量濃度為40 mg·L?1,它不僅可高效去除養(yǎng)殖水體中的ARGs,且其價(jià)格相對(duì)低廉,具有明顯的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)[43]。
總而言之,在養(yǎng)殖前池塘清理和消毒時(shí)使用強(qiáng)氯精對(duì)水源水進(jìn)行氧化消毒,可有效降低水體中ARGs的含量,從源頭防控ARGs在養(yǎng)殖環(huán)境中的傳播。通常水源水中存在一定量的還原性物質(zhì),這有可能對(duì)氧化劑的氧化性能產(chǎn)生一定的影響,因此,在對(duì)水源水進(jìn)行氧化消毒前應(yīng)測(cè)定其COD濃度,再根據(jù)所需處理的水體容量和所選擇氧化劑的氧化性能準(zhǔn)確測(cè)算氧化劑用量。此外,對(duì)蝦養(yǎng)殖絕大多數(shù)為海水養(yǎng)殖,其水環(huán)境pH值一般在8左右,堿性環(huán)境對(duì)一些氧化劑的氧化能力有削弱作用。在使用氧化劑進(jìn)行消毒時(shí),這些環(huán)境因素都應(yīng)被考慮到,以確保其對(duì)ARGs的去除效果。
近海的養(yǎng)殖水源水是養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的主要來(lái)源;在該地區(qū)近海水源水、蓄水池水體及消毒處理后的池塘養(yǎng)殖備用水中磺胺類抗性基因最高;經(jīng)蓄水池沉淀及強(qiáng)氯精氧化消毒處理,可明顯降低水體中常見(jiàn)ARGs的含量。水體中的COD含量及其他還原性物質(zhì)會(huì)影響氧化劑的氧化效果,對(duì)不同環(huán)境應(yīng)選取不同的氧化劑,或?qū)追N氧化劑搭配使用,有利于提高漁用氧化劑對(duì)水體中ARGs的去除效果。