王振寶,徐宏志,劉冰江,霍雨猛,孫亞玲,李艷偉,吳雄,楊妍妍
(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,山東 濟南 250100;2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150036)
洋蔥(Allium cepaL.)又名圓蔥、蔥頭、球蔥等,為百合科蔥屬二年生草本植物。洋蔥于近代傳入我國,由于具有適應(yīng)性強、耐貯藏和運輸?shù)奶攸c,在我國廣泛栽培,是一種重要的出口創(chuàng)匯蔬菜[1]。洋蔥以肉質(zhì)鱗莖為主要食用器官,營養(yǎng)物質(zhì)豐富,有“蔬菜皇后”的美譽;洋蔥中含有的類黃酮、有機硫等還有一定的藥用和保健作用,其中類黃酮具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血栓形成、消炎等作用[2]。
鱗莖顏色是洋蔥的一個重要性狀,主要有紫、紅、黃、白等顏色。類黃酮類化合物是洋蔥鱗莖產(chǎn)生不同顏色的主要因素。花青素作為一種重要的類黃酮類天然水溶性色素,廣泛分布于植物細胞液中,是植物花、果實和儲藏器官等呈現(xiàn)不同顏色的主要色素之一[3]。植物花青素生物合成途徑的研究已較為成熟,是以直接前體苯丙氨酸為底物,經(jīng)過一系列酶的催化,最終形成穩(wěn)定的花色苷[4]?;ㄇ嗨睾铣擅?anthocyanidin synthase,ANS)位于花青素生物合成途徑的倒數(shù)第二步,是花青素生物合成途徑末端的限速酶,能催化無色花色素轉(zhuǎn)化為有色花色素,其表達水平的高低會影響植物組織器官中花色苷的累積,從而產(chǎn)生不同的顏色[5]。
目前,已經(jīng)從花生、黑稻、蘋果、東方百合等多種植物中克隆了ANS基因[6-9],而且研究發(fā)現(xiàn)ANS基因的表達具有組織特異性和品種特異性,如黑果枸杞果實中LrANS基因的表達量顯著高于其他組織,表達量由高到低依次為黑果、紫果、綠果、花、葉、莖、根[10];紫心甘薯塊根、莖、葉中ANS基因的表達水平顯著高于白心甘薯[11]。但有關(guān)洋蔥ANS基因的研究相對較少,繆軍等[12]2010年克隆了洋蔥花青素合成酶基因AcANS,并進行了生物信息學(xué)分析;Kim等[13]2016年鑒定出了2 個突變的ANS等位基因,能造成洋蔥花青素合成酶失活,從而影響花青素合成。本研究以30 天苗齡的紫皮和黃皮洋蔥幼苗為試材克隆ANS基因片段,并對其在兩種皮色洋蔥幼苗不同組織中的表達特性進行研究,以期為洋蔥ANS基因全長序列獲得和功能研究奠定基礎(chǔ)。
供試材料為紫皮洋蔥育種系175F 和黃皮洋蔥育種系DH17-1 的30 天苗齡幼苗,均定植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗基地。于2021年10月13 日分別取幼苗的新鮮根、葉鞘和葉片,迅速放入液氮中冷凍,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
洋蔥基因組總DNA 采用快捷型植物基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen,北京)提取,具體操作參照說明書。
洋蔥總RNA 采用Trizol(Invitrogen 公司)法提取,參照說明書進行操作。取完整性良好的總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶生物工程大連有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
分別以洋蔥基因組DNA 和反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板擴增洋蔥花青素合成酶基因片段。所用目的基因上游引物AcANS-F 序列為5′-CTAACGATCAATCTAAAGGGA - 3′, 下游引物AcANS-R 序列為5′-GCAGTATGAACGATAAGGCAC-3′,由青島蔚來生物科技有限公司合成。
PCR 反應(yīng)總體積為25 μL,其中,2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,模板1 μL,上下游引物各1 μL,用滅菌蒸餾水補齊至25 μL。擴增程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸30 s,35 個循環(huán);最后72℃保溫10 min,4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測,并拍照記錄。
PCR 擴增產(chǎn)物送青島蔚來生物科技有限公司測序。
利用DNAMAN 和Blast(http:/ /www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行序列比對分析。
分別從兩種皮色洋蔥幼苗的根、葉鞘和葉片中提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以Actin為內(nèi)參[14],上游引物AcActin-F 序列為5′-ACACGGCCTGGATAGCAACAT-3′,下游引物AcActin-R序列為5′-AGAGCAGTATTCCCAAGCATT-3′,由青島蔚來生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系參照1.3,通過PCR 擴展產(chǎn)物條帶的亮度將cDNA 模板調(diào)整為基本一致的濃度,擴增程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸30 s,30 個循環(huán);最后72℃保溫10 min,4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測,并拍照記錄。然后用基因特異引物AcANS-F 和AcANS-R 進行PCR擴增,擴增程序同上,擴增30 或35 個循環(huán),擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測,并拍照記錄。
根據(jù)已報道的花青素合成酶基因序列設(shè)計引物,分別以紫皮和黃皮洋蔥的基因組DNA 和反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板進行擴增,均擴增出1 條特異條帶(圖1)。以基因組DNA 為模板在兩種皮色洋蔥中均擴增出約510 bp 的目的片段,與預(yù)期片段大小相吻合;以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板在兩種皮色洋蔥中均擴增出約400 bp 的目的片段。分別將目的片段回收測序。
圖1 不同皮色洋蔥幼苗中AcANS 基因的PCR 擴增結(jié)果
經(jīng)測序分析和Blast 比對,克隆到的目的基因片段序列與已報道的洋蔥ANS等位基因序列的相似度均在97%以上,確認為AcANS基因片段。利用DNAMAN 軟件對從兩種皮色洋蔥中克隆的AcANS基因片段序列進行對比分析,由圖2 可以看出,克隆得到的兩種皮色洋蔥的AcANS基因組序列長度均為497 bp,堿基序列也完全一致,不存在多態(tài)性位點;兩種皮色洋蔥AcANS基因的編碼序列長度均為390 bp,堿基序列也完全一致,且編碼區(qū)包含一個107 bp、符合GT-AG 規(guī)則的內(nèi)含子。表明克隆得到的兩種皮色洋蔥AcANS基因完全一致,且無多態(tài)性位點。
圖2 不同皮色洋蔥AcANS 基因組序列與編碼序列比對結(jié)果
以Actin基因作為內(nèi)參,采用半定量RT-PCR對紫皮和黃皮洋蔥幼苗根、葉鞘、葉片中的AcANS基因表達情況進行分析,結(jié)果(圖3)顯示,兩種皮色洋蔥的AcANS基因均表現(xiàn)為葉鞘中表達量最高,葉片中次之,根中不表達;在相同條件下,紫皮洋蔥葉鞘和葉片中AcANS基因的表達量明顯高于黃皮洋蔥,且在擴增30 個循環(huán)時,紫皮洋蔥葉鞘中可以檢測到AcANS基因的表達,而黃皮洋蔥中未檢測到。說明洋蔥苗期AcANS基因的表達具有組織特異性,后期顏色越深的部位AcANS基因的表達量越高,而且紫皮洋蔥中AcANS基因的表達量更高,這為后期鱗莖顏色不同奠定了基礎(chǔ)。
圖3 AcANS 基因在兩種皮色洋蔥幼苗不同組織中的表達情況
花色苷的合成需要PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等結(jié)構(gòu)基因的參與[4],這些基因的表達或表達量上調(diào)都可以造成植物組織器官中花色苷的累積,從而產(chǎn)生顏色上的差異?;ㄇ嗨睾铣擅?ANS)可以催化無色花青素轉(zhuǎn)化為有色花青素[15]。ANS基因的表達與花青素的累積量呈正相關(guān),顏色越深或越鮮艷的組織部位中ANS基因的表達量越高[15-17]。本研究結(jié)果也表明,AcANS基因在洋蔥幼苗的葉鞘中表達量最高,其次是葉片中,根中不表達,而且紫皮洋蔥中的表達量明顯高于黃皮洋蔥,這為后期鱗莖產(chǎn)生顏色上的差異奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。
花青素合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子和外界環(huán)境因素的共同調(diào)控,轉(zhuǎn)錄因子主要包括MYB、bHLH 和WD40 三大類[18]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子是植物花青素合成途徑最廣泛的調(diào)節(jié)因子,也是花青素生物合成中MBW 復(fù)合物的主要調(diào)控因子,能夠正、負調(diào)控植物花青素的合成。如在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達PsMYB58基因能夠顯著上調(diào)煙草花青素生物合成途徑中ANS等結(jié)構(gòu)基因的表達[19];在水仙中過表達NtMYB2基因能夠抑制水仙花青素生物合成途徑各結(jié)構(gòu)基因的表達[20]。此外,MYB 轉(zhuǎn)錄因子還可以與其它轉(zhuǎn)錄因子如bHLH、WD40 等共同作用,形成MBW 復(fù)合物,調(diào)控花青素的合成。本研究分別克隆了紫皮、黃皮洋蔥的AcANS基因片段,序列比對結(jié)果表明兩個片段不論基因組序列還是編碼序列都完全一致,也不存在多態(tài)性位點,并且AcANS基因在兩種皮色洋蔥中均能正常轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異,在紫皮洋蔥中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于黃皮洋蔥,推斷這種差異的產(chǎn)生可能是MYB 等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的結(jié)果,因此,后續(xù)有必要克隆洋蔥MYB 轉(zhuǎn)錄因子,研究其與AcANS基因以及花青素生物合成途徑其他結(jié)構(gòu)基因的關(guān)系。
洋蔥定植前很難通過幼苗準確判斷后期蔥球的顏色,而實際生產(chǎn)中,在種子或幼苗階段就能鑒定出皮色對于洋蔥種子純度檢測及種質(zhì)資源鑒定具有重要意義。吳雄等[21]對洋蔥花蕾期可育群體和不育群體進行cDNA-SRAP 分析獲得了差異表達片段,在此基礎(chǔ)上開發(fā)了可以鑒定洋蔥細胞核育性恢復(fù)基因的cDNA 分子標記,該分子標記僅在恢復(fù)系花蕾中存在擴增,而其它組織部位和育性材料中均不存在擴增,可以有效鑒定洋蔥恢復(fù)系材料。鑒于此,本研究利用AcANS基因表達水平的差異,以30 天苗齡紫皮、黃皮洋蔥葉鞘cDNA 為模板進行PCR 擴增,擴增30 個循環(huán)時,所有紫皮洋蔥中均有特異性擴增片段,而黃皮洋蔥中無擴增,因此可以作為cDNA 分子標記用于在洋蔥30 天苗齡時判斷后期蔥球的顏色,與傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定相比所需時間短、用地少、成本低、在苗期即可達到鑒定種子純度的目的,可應(yīng)用于洋蔥種質(zhì)資源鑒定和輔助育種等方面。
本研究克隆了不同皮色洋蔥AcANS基因部分基因組序列和編碼序列,為全長基因序列的克隆奠定了基礎(chǔ);分析了AcANS基因在兩種皮色洋蔥幼苗各組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)其表達具有明顯的組織特異性和品種特異性,這為進一步弄清洋蔥鱗莖不同皮色發(fā)生的分子機制提供了參考。另外發(fā)現(xiàn),可利用不同皮色洋蔥葉鞘中AcANS基因表達水平的差異作為cDNA 分子標記,在30 天苗齡時就區(qū)分出紫皮和黃皮洋蔥。