李凌燕，陳紅，馬玥，張旭冬，陳子言，王顥潛，張秀杰，梁晉剛

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442)

近年來，轉(zhuǎn)基因作物的種植和商業(yè)化在全球范圍內(nèi)迅速發(fā)展。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAAA)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，截至2018年全球已經(jīng)有70 多個國家種植進(jìn)口轉(zhuǎn)基因作物，轉(zhuǎn)基因作物種植面積已經(jīng)達(dá)到1.9 億hm2[1]。隨著轉(zhuǎn)基因作物的大范圍推廣，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度已經(jīng)成為全球轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的重要手段。我國頒布?農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法?對我國轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行管控[2]以保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，而建立可靠的定量檢測方法是保障轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識制度順利實(shí)施的必然技術(shù)要求。

實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)是利用PCR 擴(kuò)增過程中熒光信號的積累，實(shí)現(xiàn)對PCR 反應(yīng)進(jìn)程的實(shí)時監(jiān)測，最后通過建立雙標(biāo)準(zhǔn)曲線以達(dá)到對DNA 定量分析的目的，具有高靈敏性、可檢測單個細(xì)胞基因、高特異性和準(zhǔn)確性、操作簡單快捷和安全無污染等優(yōu)點(diǎn)。目前大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物品系如轉(zhuǎn)基因玉米[3]、水稻[4]、棉花[5]等已經(jīng)建立PCR 定量檢測系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 是由孟山都遠(yuǎn)東有限公司開發(fā)的轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米，其中插入耐除草劑基因(dom、pat)，表現(xiàn)出對麥草畏和草銨膦良好的抗性。目前國內(nèi)外還沒有對該轉(zhuǎn)基因作物的定量檢測方法， 因此建立轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 的定量檢測方法對其有效監(jiān)管和轉(zhuǎn)基因的檢測評價是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 及其受體玉米種子均為2019年由孟山都遠(yuǎn)東有限公司提供。

其他轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣和非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花等樣品均由本實(shí)驗(yàn)室保存。各種混樣的制備方法:多種轉(zhuǎn)化體按1%質(zhì)量百分比混合而成，不足部分用相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因作物補(bǔ)齊(表1)。

表1 轉(zhuǎn)基因作物混合樣品

1.1.2 主要試劑 植物基因組DNA 提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；TaqManTMGene Expression Master Mix、DL1000 DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 臺式冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；Q5000 超微量紫外分光光度計(jì)(Quawell)；CFX 96熒光定量PCR 擴(kuò)增儀(Bio－Rad，美國)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取 將轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419 及其受體種子育苗。按照植物基因組DNA 提取試劑盒操作說明書提取玉米植株基因組DNA，其余轉(zhuǎn)基因混樣和非轉(zhuǎn)基因樣品分別提取DNA，分光光度計(jì)測定濃度，用1×TE 緩沖液稀釋至50 ng/μL 用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與篩選 利用探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 8 在序列兩端設(shè)計(jì)熒光探針和引物，并進(jìn)行引物/探針正交組合，按照農(nóng)業(yè)部2259 號公告－4－2015 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為80～200 bp 的要求選出引物/探針組合[6]。

以1.2.1 提取的轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制10%的DNA 作為模板，采用通用實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序[7]，根據(jù)結(jié)果選擇擴(kuò)增信號最強(qiáng)和Ct 值最小的引物/探針組合作為定量檢測方法的候選引物。

1.2.3 反應(yīng)體系優(yōu)化 以1.2.1 提取的轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制10%的DNA 作為模板，探針濃度分別設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，引物濃度為探針濃度的2倍，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)Ct 值篩選最優(yōu)組合。

1.2.4 特異性檢測 以1.2.1 提取的轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制1%DNA 作為陽性對照，受體玉米DNA 為陰性對照，采用其他轉(zhuǎn)基因作物混樣和非轉(zhuǎn)基因作物DNA進(jìn)行特異性檢測。

1.2.5 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以1.2.1 提取的轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，稀釋成5 個不同含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品(表2)，以優(yōu)化后的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 反應(yīng)，每個PCR 反應(yīng)設(shè)置3 個平行。根據(jù)PCR 反應(yīng)的Ct值和初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)分別繪制MON87419和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體檢測體系中的DNA 含量及拷貝數(shù)

1.2.6 正確度及精密度檢測 以1.2.1 提取的轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 基因組DNA 為初始濃度，配制5%、1%和0.1%的DNA 樣品，以1.2.3 優(yōu)化后的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 反應(yīng)。每個反應(yīng)3 個平行，共進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，按照以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)基因含量:MON87419 轉(zhuǎn)基因含量(%) ＝MON87419 拷貝數(shù)/zSSIIb拷貝數(shù)×100。計(jì)算多次測試的偏差(Bias)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.7 定量限(LOQ)測定 目標(biāo)濃度參考?xì)W盟閾值0.9%，本方法將目標(biāo)濃度設(shè)定為1%。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2259 號公告－5－2015 標(biāo)準(zhǔn)[8]規(guī)定轉(zhuǎn)基因檢測方法確定定量限不高于0.1%。

采用18 份轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 含量為0.1%(PCR 反應(yīng)體系中加入100 ng 模板)的DNA樣品進(jìn)行定量測試。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算平均值、變異率(CV)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)及偏差(Bias)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物、探針設(shè)計(jì)與篩選

鑒于5′端GC 含量較低，僅在3′端設(shè)計(jì)出合適的引物與探針(表3)。

表3 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光PCR 檢測候選引物和探針

將引物與探針正交組合12 對，連同孟山都提供的引物/探針(3′－13)共13 對(表4)，按照擴(kuò)增信號最強(qiáng)和Ct 值最小的原則進(jìn)行篩選。結(jié)果(圖1)表明，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的12 對引物/探針組合均獲得特異性擴(kuò)增，其中3′－3、3′－6、3′－9 和3′－12 擴(kuò)增Ct 值最小，擴(kuò)增效果最好。按照探針設(shè)計(jì)原則，3′－9 和3′－12探針位置更接近上游，選擇3′－9 和3′－12 與孟山都提供的3′－13 進(jìn)行下一步驗(yàn)證。如圖2 所示，3′－13擴(kuò)增曲線Ct 值更小，顯著優(yōu)于其余引物/探針組合，故選用3′－13 作為候選引物/探針組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并命名為MON87419－QF/QR/QP。

表4 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光PCR 檢測引物/探針組合

圖1 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光PCR 引物探針的初步篩選

圖2 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體引物探針組合3′－9、3′－12 與3′－13 比較

2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化

如圖3 所示，隨探針濃度的增加熒光擴(kuò)增曲線上升幅度增加，Ct 值略有減少，當(dāng)探針濃度為0.4 μmol/L 時，隨著濃度的增加Ct 值基本不變。綜合考慮擴(kuò)增效率和體系配置的適用性等因素確定檢測引物濃度為0.8 μmol/L，探針濃度為0.4 μmol/L。

圖3 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光PCR 引物探針反應(yīng)濃度優(yōu)化

2.3 特異性檢測

如圖4 所示，僅在耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 中獲得擴(kuò)增曲線，而在其他轉(zhuǎn)基因作物混樣和非轉(zhuǎn)基因作物中均未獲得擴(kuò)增曲線，表明本方法篩選的引物/探針具有很好的特異性。

圖4 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光PCR檢測方法特異性測試

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液PCR 反應(yīng)的Ct 值及初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)分別繪制MON87419 和zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。結(jié)果表明，3 次平行試驗(yàn)中MON87419 和zSSIIb檢測體系的Ct 值和模板拷貝數(shù)間均有良好的線性關(guān)系。

圖5 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 正確度及精密度檢測

3 次重復(fù)測試結(jié)果顯示3 個濃度測試的偏差(Bias)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤25%(表5)。說明MON87419 檢測方法的正確度與精密度均符合農(nóng)業(yè)部2259 號公告－5－2015 的要求，具有較好的重復(fù)性。

表5 耐除草劑玉米MON87419 轉(zhuǎn)化體檢測方法的正確度和精密度測試

2.6 定量限(LOQ)的確定

如表6 所示，18 份轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 含量為0.1%的DNA 樣品偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤25%，由此確定本研究的定量限為0.1%。

表6 耐除草劑玉米MO87419 轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光PCR 方法定量限測試結(jié)果

3 討論與結(jié)論

伴隨著轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度的實(shí)施和國家對轉(zhuǎn)基因作物安全監(jiān)管力度的加強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因作物的定量檢測已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然要求。我國多側(cè)重于定性檢測轉(zhuǎn)基因作物方法的研究，如轉(zhuǎn)基因大豆MON87701、DP356043、CV－127 等定性檢測方法的建立，溫洪濤[9]、武文艷[10]等利用實(shí)時熒光定量技術(shù)分別建立了耐除草劑玉米G1105E－823C、抗蟲玉米2A－5 的定性檢測方法，Yang 等[11]以質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立了MON863、Bt11 等多個轉(zhuǎn)基因玉米定量檢測方法。但目前只有轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS 40－3－2 和抗蟲水稻TT51－1 國家標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測方法[12，13]， 未見轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 定量檢測方法的相關(guān)研究。本研究以轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 的DNA 為模板，定量準(zhǔn)確性更高，應(yīng)用范圍更廣。

目前國際認(rèn)可的轉(zhuǎn)基因定量成分分析方法主要是實(shí)時熒光定量PCR 以及數(shù)字PCR。數(shù)字PCR 無需借助標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對定量樣品的目的，國內(nèi)外研究者[14－16]利用數(shù)字PCR 的方法研制出多個玉米轉(zhuǎn)化體的定量檢測方法，但數(shù)字PCR 作為一種新興技術(shù)，成本高，設(shè)備普及率較低，尚未建立相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時熒光PCR技術(shù)具有特異高效、穩(wěn)定便捷等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于轉(zhuǎn)化體的定量檢測[17－19]，但是需要依賴建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品的絕對定量。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，建議逐步建立數(shù)字PCR 檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)際檢測中可根據(jù)樣品情況靈活結(jié)合運(yùn)用實(shí)時熒光PCR 與數(shù)字PCR，使新技術(shù)更好地服務(wù)于社會大眾。

本研究建立的實(shí)時熒光定量PCR 方法能夠準(zhǔn)確定量模板DNA 的含量，具有良好的特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性。其定量限為0.1%，能夠滿足該轉(zhuǎn)化體的檢測需要，可為耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米MON87419 的定量檢測和有效監(jiān)管提供新的技術(shù)手段和有力支撐。