梁 超，周家偉，劉亞鋒，郭健強，王清森，蘇憶欣，邢應(yīng)如，胡春曉，謝 軍，吳 靜，2，3，胡 東，2，3

（1. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2. 安徽省職業(yè)健康安全工程實驗室，安徽 淮南 232001；3. 工業(yè)粉塵深度凈化與職業(yè)健康安全安徽省教育廳重點實驗室，安徽 淮南 232001；4. 安徽中科庚久醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥 230000；5. 安徽理工大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/淮南東方醫(yī)院集團(tuán)腫瘤醫(yī)院，安徽 淮南 232033）

矽肺是由于吸入二氧化硅或二氧化硅刺激的肺纖維化疾病，是最常見的職業(yè)性疾病之一。中國是矽肺患者最多的國家，平均年確診病例超過5 000例，死亡病例超過20 000 例。全球矽肺患者中歐洲超過300 萬，美國超過200 萬［1］。矽肺常與巨噬細(xì)胞受體激活、炎癥小體有關(guān)，二氧化硅吸入肺后被巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子刺激上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞的募集，成纖維細(xì)胞被刺激后分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生膠原纖維［2，3］。已證明二氧化硅可以刺激PI3K 蛋白激酶調(diào)節(jié)自噬體積累從而促進(jìn)矽肺發(fā)展［4］，也可以通過抑制NFκB 或TGF-β 抑制矽肺進(jìn)程［5］，但人們對早期矽肺的關(guān)鍵通路并不清楚，無有效的手段可以進(jìn)行早期矽肺的識別、診斷和治療［6］，所以對早期矽肺的深入研究有著重要的臨床意義和社會意義。

根據(jù)矽肺證型的特點，古代中醫(yī)學(xué)家利用中藥以補為法，以通為用，通補兼施治療矽肺，中藥防己就是其中之一［7］。防己入藥歷史悠久，在《神農(nóng)本草經(jīng)》《傷寒雜病論》《藥性論》等古書中均有記載，防己在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載味苦性寒，具有治療風(fēng)濕水腫、濕疹脈浮的功效［7］。在現(xiàn)代醫(yī)療中具有抗腫瘤，抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，保護(hù)心血管等作用。研究表明粉防己主要的化學(xué)成分是粉防己堿（tetrandrine），為喹啉類生物堿，具有抗腫瘤，抗炎、抗纖維化?？刮蔚人幚碜饔茫?］。臨床研究表明粉防己堿素治療矽肺的臨床效果顯著，可以改善患者的肺功能水平［8］。同時發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以減少脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的爆發(fā)［9］，減少氧自由基的產(chǎn)生和腫瘤壞死因子-α（TGF-α）。白介素-6（IL-6）等炎癥因子的積累，延緩矽肺前期的炎癥階段，減少膠原纖維的產(chǎn)生，改善肺部纖維化形成［10］。本研究基于前期課題組的中藥研究成果，采用矽肺患者基因、二氧化硅滴注小鼠基因和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)三種數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選和預(yù)測，通過分子對接和體外實驗驗證，探究粉防己堿治療早期矽肺的關(guān)鍵通路，為早期矽肺的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片及靶點基因

矽肺患者的相關(guān)芯片數(shù)據(jù)來源于文獻(xiàn)，本研究收集了10 例矽肺患者和7 例正常人的肺組織RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，10 例矽肺患者和7 例正常人的肺組織均來自于無錫市人民醫(yī)院，肺組織在肺移植時獲得，取樣時避開了淋巴結(jié)和器官，所有參與者都給出書面知情同意書且獲得了南京醫(yī)科大學(xué)機構(gòu)審查委員會和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所的批準(zhǔn)［11］。二氧化硅滴注大鼠的相關(guān)芯片數(shù)據(jù)來自 于GEO 數(shù) 據(jù) 庫［12］（the Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。在GEO 數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“矽肺”，經(jīng)篩選得到芯片原始數(shù)據(jù)GSE188520 以及平臺注釋文件GPL2 5290，其中GSE188520 中樣本包括6 只普通大鼠和6 只二氧化硅滴注大鼠。通過使用limma 包［13］對上述芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異化分析，差異基因的篩選條件為P＜0.05，log（fold change，F(xiàn)C）＞1 或＜-1，將篩選后的基因按照log FC 絕對值大小進(jìn)行排序，上調(diào)和下調(diào)排名前一百的基因進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 矽肺靶點的收集

在OMIM 數(shù)據(jù)庫［14］、CTD 數(shù)據(jù)庫［15］、GeneCard數(shù)據(jù)庫［16］中以“矽肺”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，運用靶點交集可視化工具［17］將交集靶點進(jìn)行提取構(gòu)建。

1.3 功能富集分析

為說明篩選出的關(guān)鍵基因和靶點參與的信號通路和發(fā)揮的生物學(xué)功能，使用R studio 軟件并利用R/ggplot2、limma、pheatmap、ggsci、dplyr 包對關(guān)鍵差異基因進(jìn)行了基因本體分析和信號通路富集分析［18］。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用圖

不同基因集篩選出來的通路進(jìn)行交集得到關(guān)鍵通路，將關(guān)鍵通路相關(guān)靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫［19］，物種設(shè)置為“Home sapiens”，保存下載文件為tsv 格式，導(dǎo)入cytoscape 3.8.0 進(jìn)行美化后得到關(guān)鍵蛋白［20］。

1.5 分子對接

在PDB［21］數(shù)據(jù)庫中關(guān)鍵蛋白的格式化學(xué)結(jié)構(gòu)，下載為PDB 格式。在PubChem［22］中下載粉防己堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保存為SDF 格式。利用Schrodinger 軟件中的Protein Preparation Wizard 進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)優(yōu)化，選擇保留或刪除鏈、水域和配體等，修復(fù)填充丟失的側(cè)鏈以及進(jìn)行能量最小化。在Review and Modify 選項中進(jìn)行配體、水位置和電荷校正，在Refine 選項中進(jìn)行最后蛋白結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。通過Lig-Prep 進(jìn)行配體準(zhǔn)備，加氫、去鹽、中和帶電基團(tuán)、產(chǎn)生質(zhì)子化狀態(tài)最后產(chǎn)生互變異構(gòu)結(jié)構(gòu)。軟件的Ligand Docking 模塊用于分子對接，通過結(jié)合能來評價藥物與蛋白結(jié)構(gòu)的親和力，最后用pymol 修飾表現(xiàn)。

1.6 MTS 檢測細(xì)胞凋亡率

用PBS 清洗培養(yǎng)皿兩遍后，用胰酶消化細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)不同選擇合適的胰酶消化時間，胰酶消化后吸取到15 mL 離心管中，離心5 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，離心后上清液倒掉，用PBS 清洗再次離心5 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min。倒上清液后加1 mL 培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備計數(shù)，將細(xì)胞接種到96 孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度在5×103左右，每孔加入培養(yǎng)基100 μL，每個樣本重復(fù)3～5 孔，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約6 h 后加入不同濃度的藥物，放入培養(yǎng)箱24 h后，每孔加入MTS 溶液20 μL，再次放入培養(yǎng)箱4 h后測定吸光度值。

1.7 Q-PCR 測定細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

將細(xì)胞樣品用PBS 洗凈加入1 mL Trizol，在冰上放置5 min，吹打混勻后放入1.5 mL 無RNA 酶EP 管中，加入氯仿200 μL，震蕩混勻靜置10 min。4 ℃12 000 r/min 離心15 min，用無RNA 酶槍頭吸取上清液加入到500 μL 異丙醇中震蕩靜置10 min，4 ℃12 000 r 離心10 min 收集RNA 沉淀，用75%無水乙醇洗滌后離心5 min 去上清，自然風(fēng)干后加入適量DEPC 水溶解沉淀。隨后上機測RNA 濃度，各組RNA 量調(diào)整到同一水平，配置逆轉(zhuǎn)錄體系。逆轉(zhuǎn)錄完成后將cDNA、熒光染料和不同引物配置成不同的混合體系上機。

1.8 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞樣品用PBS 洗滌后，根據(jù)細(xì)胞量的多少，加入還有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，4 ℃冰箱放置30 min 后，取細(xì)胞混合液離心，去上清取沉淀，測量不同組的細(xì)胞濃度并調(diào)整到同一濃度。各組蛋白用8%SDS-PAGE 分離蛋白，在冰水中電轉(zhuǎn)80 min，將蛋白轉(zhuǎn)模至PVDF 膜，用BSA 封閉液封閉1 h 后與一抗結(jié)合，放入4 ℃冰箱過夜，洗膜后與二抗結(jié)合60 min，再次洗膜后上機，最后獲得的電泳條帶圖［23］。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 矽肺差異基因表達(dá)篩選

為了揭露矽肺差異基因表達(dá)情況，首先分析7例正常人和10 例矽肺患者的肺實質(zhì)的單細(xì)胞測序情況［11］，共獲得2 065 個差異基因，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后根據(jù)limma 包的分析，分別篩選出上調(diào)和下調(diào)基因各100 個。其次從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE188520，其中包括了6 只正常大鼠和6 只二氧化硅誘導(dǎo)大鼠，共獲得2 291 個差異基因，通過R 包的差異基因篩選，分別篩選出上調(diào)和下調(diào)基因各100 個。最后利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過Genecards、CTD、OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索，共得到與矽肺疾病相關(guān)803 個基因，通過繪制UpSet 圖，獲得交集基因129個，上述基因被認(rèn)為是與矽肺有密切聯(lián)系的基因。見圖1。

圖1 關(guān)鍵矽肺差異基因篩選Fig 1 Screen of key silicosis differential genes

2.2 矽肺關(guān)鍵差異基因KEGG 通路富集分析

首先將正常人與矽肺患者的差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出13 條KEGG 通路，其中細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用（ECM-receptor interaction）與纖維化的形成有關(guān)。人瘤病毒感染（human papillomavirus infection）與細(xì)胞周期及凋亡有關(guān)，IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）與細(xì)胞的生長、分化、炎癥等有關(guān)。其次將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫的交集基因通路富集后共篩選出166 條通路，主要的信號通路有AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路、受體因子相互作用信號通路等。最后將矽肺大鼠的差異基因進(jìn)行通路富集后篩選出22 條通路，主要有胃酸分泌、IL-17 信號通路、瘧疾、阿米巴病等信號通路有關(guān)，分析結(jié)果表明IL-17 信號通路可能是影響矽肺的關(guān)鍵通路。見圖2。

圖2 差異基因KEGG 通路分析Fig 2 Analysis of differential gene KEGG pathway

2.3 GO 富集分析

通過R 語言對矽肺患者的差異基因進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示共有282 個生物過程、33 個細(xì)胞組分和35 個分子功能。其中主要結(jié)果包括纖毛運動、細(xì)胞外基質(zhì)組織、T 細(xì)胞的活化、參與免疫反應(yīng)中中性粒細(xì)胞的活化等生物過程，G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、膠原蛋白結(jié)合、生長因子結(jié)合、Wnt 蛋白結(jié)合等分子功能，活動纖毛、含膠原纖維的細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜等細(xì)胞組分。其次對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示了2 576 個生物過程、66 個細(xì)胞組分和142 個分子功能，生物過程包括對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、活性氧代謝過程、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等，分子功能包括細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、受體配體活性、G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等，細(xì)胞組分包括囊泡腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物等，最后對矽肺大鼠的差異基因進(jìn)行GO分析，包括Toll 樣受體信號通路、細(xì)胞對腫瘤壞死因子反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激反應(yīng)等生物過程，糖胺聚糖結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、趨化因子活性等分子功能，細(xì)胞組分與上述兩組細(xì)胞組分大體相同。見圖3。

圖3 差異基因GO 富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of differential gene

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中，靶基因用節(jié)點表示，靶點之間的連線代表基因之間的相互作用，將最低互動分?jǐn)?shù)設(shè)置為最高置信度。將IL-17 信號通路所包含的靶基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，按照節(jié)點之間的交互分?jǐn)?shù)由高到低進(jìn)行排列，分?jǐn)?shù)較高的靶基因大多與MAPK 信號通路有關(guān)，且這些靶點大多與炎癥過程有關(guān)，說明IL-17 信號通路中可能起關(guān)鍵作用的是MAPK 信號通路，從而促使炎癥因子高表達(dá)促進(jìn)矽肺的發(fā)展。見圖4。

圖4 IL-17 信號通路蛋白互作圖Fig 4 IL-17 signaling pathway protein interaction

2.5 分子對接結(jié)果

將IL-17 信號通路的關(guān)鍵蛋白與小分子化合物粉防己堿進(jìn)行分子對接，確定兩者結(jié)合位置即活性口袋大小，并顯示出小分子和關(guān)鍵蛋白之間氫鍵作用位置。 對接親和力分?jǐn)?shù)通過薛定諤軟件（Schr?dinger）計算得出。分子對接結(jié)果表明，粉防己堿與MAPK 通路中的關(guān)鍵靶點RAF、ERK 之間有良好的結(jié)合力。以上結(jié)果間接證明，粉防己堿可能通過調(diào)控MAPK 信號通路中的RAF/MEK/ERK通路發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而對早期矽肺產(chǎn)生影響。見圖5。

圖5 粉防己堿與通路蛋白對接模式圖Fig 5 Docking of tetrandrine and pathway protein pattern diagram

2.6 細(xì)胞實驗

2.6.1 粉防己堿對巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡率的影響 在巨噬細(xì)胞系THP-1 中，隨著藥物濃度增加，粉防己堿抑制巨噬細(xì)胞增殖的能力逐漸增強，當(dāng)藥物濃度為5 μmol/L 時，細(xì)胞的凋亡率為20%，當(dāng)藥物濃度為10 μmol/L 時，細(xì)胞的凋亡率為83%，數(shù)據(jù)顯示當(dāng)加藥濃度大于5 μmol/L，細(xì)胞凋亡率明顯增加，不適合用于細(xì)胞實驗，在巨噬細(xì)胞中加藥濃度設(shè)置為5 μmol/L 是最適濃度。在上皮細(xì)胞系BEAS-2B 中，隨著藥物濃度的增強，上皮細(xì)胞的凋亡率呈線性增長趨勢，在5 μmol/L 時，細(xì)胞的凋亡率為5%，在10 μmol/L 時，細(xì)胞的凋亡率為16%。根據(jù)對不同加藥濃度時細(xì)胞凋亡率的計算，當(dāng)加藥濃度為20 μmol/L 時，是效果最佳的濃度。見表1。2.6.2 粉防己堿對巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 水平的影響 TNF-α 主要由巨噬細(xì)胞和活化T 細(xì)胞釋放，不但可以刺激其他促纖維因子，還可以刺激TGF-β 促進(jìn)膠原的形成。IL-1β、IL-1α 可誘導(dǎo)吸附炎癥細(xì)胞，調(diào)節(jié)其他炎癥因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。利用PCR 檢測加硅組和加藥組中炎癥因子的表達(dá)。與正常組相比，巨噬細(xì)胞加硅組的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表達(dá)均升高（P＜0.05），其中TNF-α 和TGF-β 的表達(dá)顯著上升（P＜0.01），與加硅組相比，粉防己堿組的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表達(dá)明顯下降（P＜0.05），其 中TNF-α 的 表 達(dá) 量 下 降 最 為 顯 著P＜0.001）。與正常組相比，上皮細(xì)胞加硅組的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表達(dá)均升高（P＜0.05），其中TNF-α 的表達(dá)顯著上升（P＜0.001），與加硅組相比，加藥組的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表1 粉防己堿對巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡的影響（n=3，±s）Tab 1 Effect of tetrandrine on apoptosis of macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

表1 粉防己堿對巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡的影響（n=3，±s）Tab 1 Effect of tetrandrine on apoptosis of macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

細(xì)胞巨噬細(xì)胞F P分組(μmol/L)5 10 50 100 5 10 50 100凋亡率（%）22.01±1.53 82.98±3.80 87.05±1.20 83.27±0.88 4.50±0.82 15.68±0.64 72.51±2.60 78.18±0.80 358.30＜0.000 1上皮細(xì)胞433.70＜0.000 1

表2 各組巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 炎癥因子的表達(dá)情況（n=3，±s）Tab 2 Expression of TNF-α，TGF-β，IL-1β，IL-1α in macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

表2 各組巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 炎癥因子的表達(dá)情況（n=3，±s）Tab 2 Expression of TNF-α，TGF-β，IL-1β，IL-1α in macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

細(xì)胞指標(biāo)F P巨噬細(xì)胞TGF-α 27.78＜0.001 TNF-β 65.94＜0.000 1 IL-1α 19.45＜0.01 IL-1β 27.83＜0.01上皮細(xì)胞TGF-α 35.02＜0.001 TNF-β 24.91＜0.01 IL-1α 46.10＜0.001 IL-1β分組Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet表達(dá)量1 2.92±0.38 1.19±0.47 1 2.49±0.30 1.47±0.25 1 1.41±0.26 0.35±0.25 1 1.37±0.25 0.49±0.06 1 2.47±0.21 0.78±0.41 1 4.43±1.25 0.49±0.29 1 2.333±0.43 0.39±0.06 1 2.74±0.59 0.52±0.19 31.97＜0.001

2.6.3 粉防己堿對上皮細(xì)胞中E-Cadherin、N-Cadherin 和Vimentin 水平的影響 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在矽肺進(jìn)展中起到重要作用，上皮細(xì)胞損傷可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化從而誘發(fā)肺纖維化，在轉(zhuǎn)變的過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 的表達(dá)降低，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin 和vimentin 逐漸升高，使上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。利用WB 檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)，正常組相比，加硅組的E-Cadherin 表達(dá)顯著下降（P＜0.01）、N-Cadherin 表達(dá)顯著上升（P＜0.000 1）、Vimentin 表達(dá)升高但并不顯著。相較于加硅組，加藥組的E-Cadherin 表達(dá)顯著上升（P＜0.01）、N-Cadherin 表達(dá)顯著下降（P＜0.000 1）、Vimentin 表達(dá)下降但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果證明粉防己堿起到抑制上皮細(xì)胞進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。見圖6 及表3。

表3 各組BEAS-2B 上皮細(xì)胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 蛋白的表達(dá)情況（n=3，±s）Tab 3 Expression of E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin protein in BEAS-2B epithelial cells in each group（n=3，±s）

表3 各組BEAS-2B 上皮細(xì)胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 蛋白的表達(dá)情況（n=3，±s）Tab 3 Expression of E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin protein in BEAS-2B epithelial cells in each group（n=3，±s）

指標(biāo)F P分組 表達(dá)量E-Cadherin Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet 1.000 0±0.000 0 0.490 0±0.105 3 1.070 0±0.147 3 1.000 0±0.000 0 1.350 0±0.053 4 0.366 6±0.030 5 1.000 0±0.000 0 1.100 0±0.245 8 0.700 0±0.185 9 27.500＜0.001 N-Cadherin 651.200＜0.000 1 Vimentin 4.875 NS

圖6 各組BEAS-2B 上皮細(xì)胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 蛋白的表達(dá)情況Fig 6 Expression of E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin protein in BEAS-2B epithelial cells in each group

2.6.4 粉防己堿對巨噬細(xì)胞中磷酸化后的RAF 及ERK 蛋白水平的影響 RAF 蛋白是由RAF 基因編碼的蛋白激酶，在MAPK 信號通路中起著重要作用，RAF 蛋白可以調(diào)節(jié)下游的MEK 蛋白和ERK 蛋白活性，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖，凋亡，炎癥反應(yīng)等功能。利用WB 檢測MAPK 相關(guān)蛋白的表達(dá)，與正常組相比，加硅組的RAF 蛋白和ERK 蛋白的磷酸化水平明顯升高（P＜0.01）。與加硅組相比，粉防己堿組的RAF 蛋白和ERK 蛋白的磷酸化水平明顯降低（P＜0.000 1），證明粉防己堿可以抑制RAF 蛋白和ERK 的磷酸化水平，從而參與細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。見圖7 及表4。

表4 各組THP-1 巨噬細(xì)胞Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況（n=3，±s）Tab 4 Expression of Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 in THP-1 macrophage cells in each group（n=3，±s）

表4 各組THP-1 巨噬細(xì)胞Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況（n=3，±s）Tab 4 Expression of Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 in THP-1 macrophage cells in each group（n=3，±s）

指標(biāo)F P分組 表達(dá)量Phospho-c-Raf 64.04＜0.000 1 Phospho-ERK1/ERK2 Control Silicon Tet Control Silicon Tet 1.000 0±0.000 0 1.330 0±0.111 7 0.700 0±0.035 9 1.000 0±0.000 0 1.556 0±0.088 8 0.831 2±0.029 6 147.7＜0.000 1

圖7 各組THP-1 巨噬細(xì)胞Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 蛋白的表達(dá)情況（n=3，±s）Fig 7 Expression of Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 in THP-1 macrophage cells in each group（n=3，±s）

3 討論

矽肺是一種常見的職業(yè)病，主要是肺部炎癥和纖維化，嚴(yán)重時會導(dǎo)致心臟衰竭，具有不可逆性。大多矽肺患者就診時已是晚期，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且預(yù)后較差，當(dāng)前矽肺治療并不樂觀［24，25］。近年來，矽肺的治療手段和發(fā)病機制逐漸成為了熱點話題，相關(guān)文章對矽肺發(fā)病機制進(jìn)行了集中討論，甚至有小部分方法在矽肺模型中成功開展［3］，但對矽肺發(fā)展機制的相關(guān)研究仍然不足。粉防己堿是從中藥漢防己植物中提取出的藥物，是一種用于治療矽肺的臨床藥物［26］，因治療癌癥和腫瘤的效果被人所熟知［27，28］。研究報道，粉防己堿在抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有著顯著作用［10］。因此本研究從生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度出發(fā)，進(jìn)一步探討粉防己堿治療早期矽肺的作用機制，為之后的臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)成為了研究疾病通路和關(guān)鍵蛋白的重要手段，本研究首次將矽肺患者、二氧化硅滴注大鼠的RNA 測序數(shù)據(jù)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中與矽肺相關(guān)的靶點進(jìn)行同步分析，從不同物種，不同來源的數(shù)據(jù)中分析影響早期矽肺的信號通路。研究表明矽肺的發(fā)展與多種信號通路都有著密切的關(guān)系。Zhang 等［29］通過使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制了NF-κB 信號通路介導(dǎo)的矽肺早期肺部炎癥發(fā)生。Abd Elhameed［5］發(fā)現(xiàn)阿司匹林和磷蝦油可以使二氧化硅小鼠肺組織中的NFκB 和炎癥因子TGF-β1 下調(diào)，從而降低二氧化硅誘導(dǎo)的肺損傷。Yan 等［30］證明了PI3K/Akt 通路在二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化中起到了關(guān)鍵作用。Helal等［31］通過使用β 受體阻滯劑卡維地洛降低小鼠肺組織內(nèi)病P-AKT 和mTOR 含量從而減輕了二氧化硅誘 導(dǎo) 的 肺 纖 維 化。 Wu 等［32］發(fā) 現(xiàn) 大 黃 蟄 蟲 丸（DHZCP）可 以 通 過 調(diào) 整p38 MAPK/TGF- β1 /Smad 通路，減少炎癥因子的刺激從而抑制矽肺進(jìn)展。 Yan 等［33］利 用p38 MAPK 特 異 性 抑 制 劑SB203580 發(fā)現(xiàn)P38 MAPK 通路是大鼠矽肺纖維化和EMT 的關(guān)鍵。有文章提及炎癥因子IL-6 通過JAK2/STAT3 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的EMT，同時IL-6 也可以通過STAT3 信號誘導(dǎo)FMT 的發(fā)生［34］。Cheng等［35］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過抑制TGF -β1 信號減輕成纖維細(xì)胞的活化，抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。報道表明影響矽肺發(fā)展的通路不止一條，但哪條通路才是影響矽肺最為關(guān)鍵的通路還沒有定論。從GO 和KEGG 富集分析中發(fā)現(xiàn)三種不同數(shù)據(jù)集都存在IL-17 信號通路［36］，說明IL-17 信號通路在早期矽肺發(fā)展中有著極其重要的作用。相關(guān)文獻(xiàn)證實，IL-17是白介素家族重要的炎性細(xì)胞因子，高水平的IL-17 導(dǎo)致肺部疾病惡化、包括肺炎、哮喘等疾病，吡非尼酮可以通過抑制IL-17A 的分泌來改善二氧化硅誘導(dǎo)小鼠的肺部炎癥，其觀點與本研究所得出的結(jié)論一致，證實IL-17 信號通路在矽肺的發(fā)展中有著重要作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖表示了不同靶點之間的相互作用，其結(jié)果證實MAPK 通路在IL-17 信號通路中起著重要作用，IL-6、TNF-α、CCL2 等靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖有著較高的影響分?jǐn)?shù)，Tripathi 等［37］證明IL-6 的表達(dá)與二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化有著密切關(guān)系，Cheng等［35］證明TNF-α 表達(dá)減少可以減少成纖維細(xì)胞的活化。CCL2 是一種介導(dǎo)炎癥的趨化因子，可以促使巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子從而促進(jìn)矽肺早期的進(jìn)展，以上靶點都說明篩選出的IL-17 信號通路在早期矽肺中起到重要的作用。

粉防己堿被藥監(jiān)局批準(zhǔn)是治療矽肺的新藥，從本草粉防己提煉而出，在抗炎、抗纖維化、免疫應(yīng)答、抗氧化方面都有著重要作用，但其抗纖維化的治療效果仍存在爭議，且粉防己堿在矽肺進(jìn)展中影響的機制還未被確定［38］。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以抑制關(guān)鍵通路RAF 和ERK 蛋白的磷酸化水平和EMT 的發(fā)生，其中上皮細(xì)胞標(biāo)志物ECadherin 上調(diào)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-Cadherin 和Vimentin 表達(dá)下調(diào)。PCR 實驗發(fā)現(xiàn)，粉防己堿明顯抑制巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中IL-6、TNF-α、TGF-β 炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，粉防己堿對早期矽肺的發(fā)展有明顯抑制作用，預(yù)測其機制是降低RAF/MEK/ERK 通路磷酸化，抑制早期矽肺組織中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，降低巨噬和上皮細(xì)胞炎癥因子的釋放水平，從而影響早期矽肺的進(jìn)展。研究為矽肺治療提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，為矽肺藥物的研發(fā)和后續(xù)進(jìn)一步的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。本研究在數(shù)據(jù)采用方面仍有局限性，大部分?jǐn)?shù)據(jù)來自數(shù)據(jù)庫，可能存在數(shù)據(jù)不全的情況，關(guān)鍵通路驗證只停留在細(xì)胞水平，未能在動物體內(nèi)進(jìn)行驗證，粉防己堿治療早期矽肺的機制還需更加深入研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

梁超:文章構(gòu)思，實驗設(shè)計，生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，細(xì)胞實驗操作;周家偉、劉亞峰:生物信息學(xué)分析的指導(dǎo)和調(diào)整;郭健強、王清森:實驗操作幫助。蘇憶欣、胡春曉:實驗數(shù)據(jù)分析;謝軍、邢應(yīng)如、胡東、吳靜:論文撰寫與修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。