王田田，尹志蕓，鄧雅麗，朱 瓊，周 敏，胡思靖，吳巧麗，靳佳音，張丹娜，劉希佳，蔣柏勇，沈 姝，鄧 菲，史君明

（1.國家病毒資源庫，中國科學院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071；2.南開大學藥學院，天津 300071）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）是發(fā)熱伴血小板綜合征（SFTS）的病原體，屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）、白纖病毒科（Phenuiviridae）、班 大 病 毒 屬（Bandavirus）［1，2］。SFTSV 感 染的主要臨床癥狀包括發(fā)熱、胃腸道癥狀、肌痛、局部淋巴結病、血小板減少、肝酶水平升高等，嚴重者可發(fā)展為多器官衰竭或死亡，其病死率為13%～30%，被世界衛(wèi)生組織列為十大優(yōu)先傳染病之一［1，3］。目前發(fā)熱伴血小板減少綜合征的臨床治療主要以對癥支持性治療為主，包括：通過注射丙種球蛋白沖擊治療法（臨床個案治療有效）或激素聯(lián)合免疫球蛋白（臨床個案治療有效）增強機體免疫力，以及激素沖擊療法（臨床個案治療有效）、血漿置換（臨床治療有效）等［4-6］。由于針對SFTS 尚無有效疫苗和特效藥，特異性抗病毒藥物的研發(fā)成為亟待解決的科學問題。

SFTSV 的基因組由3 個單鏈負義RNA 片段構成，分別為大片段（L）、中等片段（M）和小片段（S）。其中L 片段編碼RNA 聚合酶RdRp，M 片段編碼糖蛋白Gn 和Gc，S 片段編碼核蛋白NP 和非結構蛋白NSs［3］。與 大 部 分 負 鏈RNA 病 毒 轉 錄 復 制 機 制 類似，SFTSV 基因組UTR 區(qū)存在保守基序，能夠與RdRp 和NP 形 成RNA-蛋 白 復 合 物（RNP）負 責SFTSV 的基因復制和轉錄［7-9］。RNP 是SFTSV 基因復制轉錄最簡需求，基于這一理論前期筆者成功構建了能表達eGFP 熒光蛋白的SFTSV 微復制子報告系統(tǒng)［10］。微復制子系統(tǒng)通過質粒轉染細胞能夠有效體現(xiàn)病毒RNA 的轉錄復制過程，啟動報告基因的表達，通過讀取報告基因表達水平分析病毒RNA 轉錄復制的效率，是研究RNA 病毒轉錄復制機制以及篩選特異性靶向RNA 復制過程藥物的重要手段［11，12］。

迄今為止，已有研究報道過幾種具有對SFTSV 抗病毒效果的藥物，包括：（1）抗病毒類：廣譜抗病毒藥物利巴韋林（細胞實驗和動物實驗有效）、干擾素聯(lián)合利巴韋林用藥（細胞實驗有效）、血漿置換聯(lián)合利巴韋林（臨床個案治療有效）、法匹拉韋（動物實驗有效）；（2）鈣通道阻滯劑（CCBs）類：鹽酸貝尼地平和硝苯地平（臨床回顧性發(fā)現(xiàn)有效）［4］。這些藥物對SFTSV 抗病毒作用的發(fā)現(xiàn)均是從“老藥新用”的角度，通過對其他病毒具有抗病毒作用的藥物針對SFTSV 抑制作用進行評估或針對臨床SFTS 案例給藥記錄進行回顧分析而被確定。從FDA 批準藥物中篩選抗SFTSV 藥物能極大縮短研發(fā)周期、降低研發(fā)成本。本研究利用SFTSV微復制子系統(tǒng)，對FDA 批準的1 430 個化合物進行抗病毒藥物篩選。進一步通過活病毒感染細胞體系對篩選獲得的藥物抗SFTSV 效果進行評估，并確定藥物作用的具體階段。本研究的發(fā)現(xiàn)將為微復制子用于SFTSV 抗病毒藥物研發(fā)提供重要的理論參考，促進SFTSV 特效藥的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒 Vero 細胞（ATCC no. CCL-81）、HEK293T（ATCC no. CRL-3216），均購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），由本實驗室保存；病毒 種 子 液 SFTSV（WCH/97/HN/China/2011 strain；S/M/L GenBank no.：JQ341190，JQ341189，JQ341188）來自于中國科學院武漢病毒研究所國家病毒資源庫。

1.1.2 化合物 Vidofludimus、硝唑尼特、麥考酚酸、嗎替麥考酚酯等1430 個FDA 批準化合物，購于Selleck 生物科技有限公司，化合物均由二甲基亞砜（DMSO）配制母液，使用時用含2 % FBS 的DEME 培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.1.3 質粒和檢測試劑 SFTSV 微復制子系統(tǒng)需要 的 質 粒 pRF42-SFTSV-MeGFP、pCAGGs-SFTSV-NP、pCAGGs-SFTSV-RdRp 均 由 實 驗 室自行構建［13］；質粒轉染試劑采用Lipofectamine 3000（ThermoFisher，美國）；鼠抗SFTSV-NP 多克隆抗體為本實驗室免疫制備［13］。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Vero 細胞、HEK-293T 細胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒培養(yǎng) 用T-75 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Vero 細胞，待細胞生長量達到80% 左右棄去舊培養(yǎng)基并加6 mL 含2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基覆蓋細胞表面，加入100 μL SFTSV WCH/97/HN/China/2011 毒 株種子液，此時MOI 約為0.1，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h ，期間每15 min 輕輕晃動培養(yǎng)瓶。孵育完成后補充6 mL 新鮮的含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，5 d 后收集培養(yǎng)瓶中的上清于4 ℃、3 000 g/min 離心10 min，然后取上清500 μL/管分裝于凍存管并-80℃保存待用。

1.2.3 病毒滴度TCID50（50% 組織培養(yǎng)感染劑量）測定 將Vero 細胞稀釋到密度約105/mL 密度用于96 孔板鋪板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待測滴度的病毒原液用含2 % FBS的DEME 培養(yǎng)基進行10 倍梯度稀釋，將病毒從10-1稀釋至10-10，并做3 組重復，其中從10-3到10-10的病毒稀釋液將用于下一步檢測。將96 孔板中的舊培養(yǎng)基棄去，每孔加入100 μL 的病毒稀釋液，每個梯度6 個復孔，共做3 組重復，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，隨即通過免疫熒光檢測病毒感染孔。通過觀察記錄每個病毒稀釋梯度下產生綠色熒光的孔的數量，若孔中有熒光則記為陽性，孔中沒有熒光則記為陰性，以Reed ＆ Muench 法計算出該病毒液的TCID50。

1.2.4 免疫熒光檢測 棄去96 孔細胞培養(yǎng)板中舊培養(yǎng)基，每孔加100 μL 4 % 多聚甲醛，避光固定30 min；用水沖洗3 遍；隨后每孔加入100 μL 0.2% Triton X-100 透化細胞15 min；用水沖洗3 遍；用PBS配制的含5%牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）封閉液于37 ℃封閉1 h 或4 ℃過夜封閉，每孔100 μL；棄掉封閉液，每孔加入100 μL 稀釋好的一抗孵育液（抗體1∶2 000 稀釋）37 ℃孵育2 h 或4 ℃過夜孵育；棄掉一抗稀釋液，用水沖洗3 次；用含1% BSA的PBS 按1∶2 000 稀釋FITC 標記的山羊抗兔血清，每孔加入100 μL 二抗稀釋液37 ℃孵育1 h；棄掉二抗稀釋液，用水沖洗3 次后即可使用熒光顯微鏡觀察記錄。

1.2.5 藥物細胞半數毒性濃度（CC50）的確定 Vero 細胞按照細胞密度約1.0×104個/孔鋪入96 孔板，每孔100 μL 體積，放入37 ℃培養(yǎng)箱24 h 后待細胞匯合度達到90 %左右；棄除舊培養(yǎng)基，將梯度稀釋好的藥物（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L），按照每孔100 μL 的體積加入到細胞孔中，每個藥物梯度做3 個實驗復孔，放在37 ℃細胞培養(yǎng)箱預孵育24 h；將96 孔板從培養(yǎng)箱中取出，按照每孔10 μL 的體系加入CCK-8 試劑，放置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h；最后通過酶標儀在450 nm 處檢測實驗組與陰性對照組的細胞活性百分比。以藥物濃度為橫坐標，細胞活性百分比為縱坐標，利用GraphPad Prism 8.0. 軟件繪制細胞活性的劑量依賴曲線并進行回歸，計算細胞半數毒性濃度（CC50）。

1.2.6 微復制子系統(tǒng)上抗病毒藥物的篩選 按2×105/孔將HEK-293T 細胞鋪入24 孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后進行下一步 實 驗 ；將 pCAGGs-SFTSV-RdRp、pRF42-SFTSV-MeGFP、pCAGGs-SFTSV-NP 3 種質粒按照質量比2∶1∶1 的比例進行混合，參照Lipofectamine 3000 轉染試劑說明書每孔2 μg 進行轉染，37 ℃培養(yǎng)。將藥物母液用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進行2 倍梯度稀釋，棄去轉染6 h 后細胞培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，每孔中加入200 μL 對應濃度的藥物稀釋液，對照孔為僅含DMSO（藥物最高濃度時所加的量）的藥物稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)42 h。隨后用高內涵分析儀進行eGFP 計數，用GraphPad Prism 8.0.1軟件的非線性回歸方法計算藥物的半數抑制濃度。

1.2.7 活病毒體系上藥物抑制SFTSV 不同感染階段的定量分析 按每孔5×104將Vero 細胞鋪入24孔板，每孔500 μL 體積，于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)24 h 待用。用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將藥物稀釋成所需濃度，用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將病毒稀釋成滴度為1×105pfu/mL，每孔加入500 μL病毒稀釋液感染細胞，按照如下方式開展藥物抑制實驗（圖1），具體包括：（1）藥物作用于整個病毒感染階段：感染前1 h 細胞培養(yǎng)孔中加入稀釋好的藥物，隨后加入稀釋好的SFTSV 病毒液共孵育1 h 后棄去舊培養(yǎng)基，換新的含有藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（2）藥物作用于病毒感染前：稀釋好的藥物與病毒液共孵育1 h 后感染細胞，且病毒與細胞孵育1 h后換上不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（3）藥物作用于病毒入侵階段：病毒與藥物同時加到細胞培養(yǎng)孔孵育1 h 后棄去舊培養(yǎng)基換上新的不含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（4）藥物作用于病毒入侵后階段：病毒感染細胞1 h 后棄去舊的培養(yǎng)基，隨后換上含有藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)23 h 后，棄掉孔中舊培養(yǎng)基，用無菌PBS 潤洗3 遍，每孔加入400 μL Trizol 作用5 min 后，用移液器吹打混勻并吸取到1.5 mL EP 管中，進行后續(xù)的RNA 提取和絕對定量分析。

圖1 藥物抑制SFTSV 不同感染階段的給藥流程圖Fig 1 Flowchart of drug administration in different stages of SFTSV infection

RT-qPCR 定量檢測SFTSV 所用引物為HEX染料標記的序列：HEX-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ-2，檢測試劑盒為HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（諾唯贊，南京，中國）。

2 結果

2.1 藥物細胞半數毒性濃度（CC50）

使用CCK-8 法檢測了候選的4 種藥物對細胞活性的影響，結果顯示各作用濃度時，細胞活性仍大于80 %，回歸分析顯示各藥物的CC50均＞100 μmol/L（表1）。因而進一步在＜100 μmol/L 的濃度范圍內研究藥物對病毒感染的抑制效果并確定藥物的IC50。

表1 4 種候選藥物的細胞半數毒性濃度（CC50）Tab 1 Median cytotoxic concentration（CC50）of four drug candidates

2.2 微復制子系統(tǒng)上抗病毒藥物的篩選

通過高內涵掃描分析1 430 個FDA 批準藥物對SFTSV 微復制子的影響，共篩選出4 種能起顯著抑制作用的藥物，分別為嗎替麥考酚酯、麥考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus。藥物梯度抑制實驗表明隨著藥物濃度的增高，藥物對SFTSV 的抑制效果逐漸增強，表現(xiàn)出強的劑量相關性（圖2）。計算分析顯示嗎替麥考酚酯、麥考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus 4 種藥物在微復制子系統(tǒng)上的半數抑制濃度分別為0.014、0.627、1.283、0.059 μmol/L。結合藥物的CC50，各藥物的治療指數（TI）均＞10，表明這些藥物安全性高（表2）。

圖2 微基因組系統(tǒng)上4 種藥物不同濃度下對SFTSV 的抑制作用Fig 2 Inhibition of SFTSV by the four drugs at different concentrations on the mini-replicon system

表2 微基因組系統(tǒng)上4 種藥物不同濃度下對SFTSV 的抑制效果和安全性Tab 2 Inhibitory effect and safety of the four drugs at different concentrations to SFTSV infection

2.3 活病毒體系上4 種藥物抑制SFTSV 不同感染階段的定量分析

為進一步確定藥物對病毒感染的作用階段，本研究在細胞水平開展了4 種不同的給藥方式：藥物全程作用于SFTSV（entire stage）、藥物作用于SFTSV 感 染 前（virion stability）、藥 物 作 用 于SFTSV 感 染 入 侵 時（entry stage）、藥 物 作 用 于SFTSV 入侵細胞后（post-entry）。結果如圖3 和表2 所示：藥物全程作用于SFTSV 時，4 種藥物在3 種濃度下對SFTSV 均有顯著抑制效果；用藥物對SFTSV 進行預處理時，4 種藥物對SFTSV 增值不起抑制作用；藥物作用于SFTSV 入侵細胞時，只有嗎替麥考酚酯在較高濃度下對SFTSV 有若的抑制效果，其余3 種藥物對SFTSV 沒有抑制效果（圖3A）；當藥物作用于SFTSV 入侵細胞后階段，4 種藥物對SFTSV 的增值抑制效果顯著，值得注意的是Vidofludimus 在3 種濃度下對SFTSV 的抑制效果均達到99% 以上。綜合結果表明4 種藥物對SFTSV的抑制作用主要發(fā)生在SFTSV入侵細胞后。

圖3 4 種藥物在SFTSV 感染細胞不同階段的抑制效果Fig 3 Inhibitory effects of the four drugs on SFTSV infected cells at different stages

表3 4 種藥物在SFTSV 感染細胞不同階段的抑制效果統(tǒng)計分析（±s）Tab 3 Statistical analysis of the inhibitory effects of the four drugs in different stages of SFTSV infected cells（±s）

表3 4 種藥物在SFTSV 感染細胞不同階段的抑制效果統(tǒng)計分析（±s）Tab 3 Statistical analysis of the inhibitory effects of the four drugs in different stages of SFTSV infected cells（±s）

實驗組t/P給藥方式整個階段入侵前入侵時入侵后整個階段入侵前入侵時入侵后整個階段藥物對照組嗎替麥考酚酯麥考酚酸硝唑尼特20 μmol/L 6.535±0.080 8.900±0.050 7.190±0.100 5.870±0.229 6.663±0.276 8.664±0.130 7.326±0.096 5.623±0.136 7.341±0.054 5 μmol/L vs.Vehicle 6.425/0.003 0.7265/0.500 1.876/0.133 3.972/0.057 13.100/0.000 1.463/0.217 0.735/0.503 4.222/0.014 0.598/0.582 10 μmol/L vs.Vehicle 13.83/0.000 2 1.210/0.292 0.350/0.743 4.463/0.047 7.19/0.002 2.046/0.110 0.708/0.518 3.076/0.037 2.397/0.075 20 μmol/L vs.Vehicle 5.034/0.007 5.984/0.004 3.837/0.019 4.971/0.038 5.953/0.004 1.632/0.178 2.739/0.052 4.965/0.008 12.160/0.000入侵前6.686±0.127 7.352/0.002 0.032/0.976 0.332/0.756 Vidofludiums入侵時入侵后整個階段入侵前入侵時入侵后8.467±0.123 8.430±0.058 7.630±0.055 7.367±0.194 8.467±0.123 8.430±0.058 7.630±0.055 7.122±0.269 8.707±0.098 6.736±0.080,n=3 6.814±0.149 6.874±0.182 8.568±0.091 7.141±0.297 7.216±0.175 7.464±0.136 5 μmol/L 6.042±0.125 8.565±0.176 7.357±0.134 6.590±0.015 6.535±0.081 8.580±0.084 7.560±0.077 5.728±0.191 8.629±0.086 6.14±0.011,n=3 6.191±0.292 7.227±0.046 6.294±0.080 7.254±0.086 7.595±0.088 4.980±0.149 10 μmol/L 6.454±0.38 8.539±0.068 7.610±0.013 6.471±0.048 7.113±0.142 8.573±0.038 7.563±0.076 5.743±0.358 8.470±0.011 6.742±0.164,n=3 7.008±0.120 6.800±0.172 5.671±0.133 7.126±0.115 7.433±0.025 4.563±0.096 6.951±0.228 6.261±0.062 5.742±0.250 7.017±0.185 7.647±0.042 4.774±0.013 1.898/0.131 1.878/0.123 18.610/＜0.0001 0.363/0.735 1.926/0.127 12.28/0.000 1.011/0.369 0.293/0.784 17.910/＜0.0001 0.049/0.963 1.220/0.290 17.37/＜0.0001 0.500/0.644 3.185/0.033 10.580/0.001 0.355/0.740 2.381/0.076 19.670/＜0.0001

3 討論

SFTSV 流行范圍不斷擴大，除中國至少15 個省，韓國、日本和越南等其他亞洲國家也陸續(xù)報道了該病，SFTSV 已嚴重威脅人類公共健康［14］。研發(fā)有效的抗SFTSV 藥物成為急需解決的科學問題。本研究通過微復制子系統(tǒng)對FDA 批準的1 430個化合物進行抗SFTSV 藥物篩選，結果表明嗎替麥考酚酯、麥考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus 4 種藥物對SFTSV 具有抑制作用，同時4 種藥物中硝唑尼特、Vidofludimus 具有較好的劑量依賴性，隨著濃度的升高對SFTSV 的抑制效果增強?；畈《靖腥炯毎Ｐ蜋z測結果顯示這4 種藥物均能明顯降低SFTSV 的拷貝數，能有效抑制活病毒感染；通過在SFTSV 感染過程的不同階段給藥，進一步確定這4種藥物主要作用于SFTSV 入侵細胞后的階段，與微復制子系統(tǒng)檢測結果一致。微復制子系統(tǒng)能夠有效體現(xiàn)病毒基因組的轉錄復制效率，通過該系統(tǒng)進行藥物篩選更能有效精準的靶向病毒的轉錄復制過程。因此，利用微復制子是不涉及活病毒操作篩選抗RNA 病毒藥物的重要且安全的手段。

本研究篩選鑒定的對SFTSV 具有抑制作用的4 種藥物的臨床應用與抗病毒并不相關。嗎替麥考酚酯［15］和麥考酚酸［16］是一種非競爭性、可逆的次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶抑制劑，具有強大的抑制淋巴細胞增殖的作用，主要用于移植術的免疫排斥治療?；赟FTSV 微復制子系統(tǒng)的測試結果顯示嗎替麥考酚酯的IC50值最小，在較低的濃度下對SFTSV 具有良好的抑制效果，提示嗎替麥考酚酯是一種潛在的有效抗SFTSV 藥物。而這類次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶抑制劑的藥物是否具有抗RNA病毒廣譜性值得深入探究。硝唑尼特是一種人工合成的硝噻柳酸酰胺的衍生物，主要用于抗原蟲、抗腸道寄生蟲［17］，也有一些研究報道該藥物具有好的抗病毒效果，例如抗犬流感病毒（IC50為0.17～0.21 μmol/L），同時表現(xiàn)出對HBV 和HCV 復制的有效抑制［18］。本研究結果進一步提示硝唑尼特的抗病毒效應可能具有廣譜性。Vidofludimus 是一種口服的二氫乳清酸脫氫酶（dihydroorate dehydrogenase，DHODH）抑制劑，是一種免疫抑制劑。盡管目前幾乎還沒有針對該化合物用于抗病毒研究的報道，但該化合物的新一代衍生物Vidofludimus calcium（又被稱為IMU-838）可用于治療一種自身免疫性疾病肌萎縮性脊髓側索硬化癥，并已進入二期臨床實驗；該衍生物對新冠病毒SARS-CoV-2、人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency type 1，HIV-1）有抑制作用［15，19-21］，提示該藥物可能具有廣譜的抗病毒作用及潛在應用價值。

解析藥物、宿主、病毒之間的復雜關系和作用機制是發(fā)現(xiàn)抗病毒作用新靶點，篩選抗病毒藥物的重要理論基礎。本研究從“老藥新用”的角度，基于微復制子和病毒感染細胞模型篩選出具有良好的抗SFTSV 效果的4 種藥物，提示“老藥新用”是快速獲得有效抗病毒藥物的重要手段。

作者貢獻度說明：

孫鑫：課題主持人，論文撰寫者，完成主要的實驗設計，并參與實驗造模取材及指標檢測等相關工作。王田田、沈姝、鄧菲、史君明：實驗設計；王田田、尹志蕓、朱瓊、鄧雅麗：實驗主要實施；周敏、靳佳音、胡思靖、張丹娜：負責實驗研究涉及細胞、試劑耗材；劉希佳、蔣柏勇、吳巧麗：抗體制備；王田田：文章執(zhí)筆；沈姝、鄧菲、史君明：文章審閱和修訂。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。

［本文編輯］ 鄒 洲 宋睿璞 朱 昊