薛俊芳，王 涵

1.舞陽縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，河南漯河 462400；2.漯河市中心醫(yī)院檢驗科，河南漯河 462000

慢性心力衰竭(CHF)為各種常見心臟病嚴重終點事件之一，是老年人死亡的主要原因，而且醫(yī)療費用較高，給患者家庭和社會帶來了沉重負擔。CHF的高發(fā)病率、高患病率和高病死率仍然是一個社會問題，其診斷和治療越來越受到重視[1]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于一類長度超過 200 個核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼 RNA，通過調(diào)節(jié)基因表達參與表觀遺傳調(diào)控。lncRNA存在于循環(huán)系統(tǒng)中，可作為反映心血管疾病局部疾病過程的獨立生物標志物[2]。研究表明，lncRNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄物(MIAT)參與了多種疾病的多個病理過程，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、心肌梗死、微血管功能障礙、心臟肥大和心肌纖維化[3]，其中心肌纖維化是心血管疾病進展為CHF的決定性因素。微小RNA(miRNA)的主要功能是影響基因穩(wěn)定性，或者通過結(jié)合非翻譯區(qū)mRNA 3′末端全部或部分抑制下游靶基因mRNA的翻譯，參與生理和病理過程，影響疾病的發(fā)生和進展[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，許多心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展受到miRNA相關(guān)信號通路的影響，如肥大和纖維化[5]。miR-214是miRNA家族成員，可通過轉(zhuǎn)錄水平抑制組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 1，提高過氧化物酶體增殖物激活受體表達，進而降低心肌細胞纖維化相關(guān)基因的表達[6]，與心血管疾病存在一定的聯(lián)系。本研究檢測CHF患者外周血中l(wèi)ncRNA MIAT和miR-214的表達，研究其對CHF患者預(yù)后價值，以期為CHF提供新的臨床預(yù)后診斷指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月在舞陽縣人民醫(yī)院確診和治療的50例CHF患者作為觀察組，均接受心電圖、胸部X線片、彩色多普勒超聲檢查，符合紐約心臟協(xié)會(NYHA)的分級標準，左室射血分數(shù)(LVEF)≤40%，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)>5.5 cm。觀察組男28例，女22例；年齡65～81歲，平均(73.71±6.53)歲；有吸煙史23例，無吸煙史27例；體重指數(shù)(BMI) 22～25 kg/m2，平均(23.28±1.25)kg/m2；空腹血糖4.02～7.47 mmol/L，平均(5.93±1.28)mmol/L；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 15～28 U/L，平均(21.34±5.87)U/L；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)13～24 U/L，平均(18.64±5.24)U/L；心功能分級：Ⅱ級21例，Ⅲ級18例，Ⅳ級11例。排除自身免疫性疾病、急性冠狀動脈綜合征、肝功能障礙、慢性感染和惡性腫瘤患者。另選取同期在本院體檢健康的受試者30例作為對照組，男16例，女14例；年齡64～79歲，平均(71.27±6.82)歲；有吸煙史14例，無吸煙史16例；BMI 23～26 kg/m2，平均(24.46±1.31)kg/m2；空腹血糖4.04～7.51 mmol/L，平均(5.71±1.65)mmol/L；AST 14～26 U/L，平均(20.17±5.38)U/L；ALT 12～25 U/L，平均(18.57±5.64)U/L。排除有心臟相關(guān)功能異常、自身免疫性疾病和高血壓病史者。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。該研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2方法 收集患者一般資料，包括LVEDD、LVEF和腦鈉肽(BNP)水平。采集患者空腹4 mL 的靜脈血液標本，置于含有乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的抗凝管中，充分混勻，并以 400×g離心 20 min分離血漿。分離的血漿儲存在-80 ℃低溫冰箱中備用，用于細胞因子的測定。

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血漿lncRNA MIAT和miR-214的表達。采用TRIzol試劑盒提取收集的血漿中的總RNA。通過紫外分光光度法檢測總RNA的純度、濃度和完整性。參照說明書采用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)進行逆轉(zhuǎn)錄。lncRNA MIAT和miR-214分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，引物由廣州天元生物技術(shù)有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系體積為15 μL。lncRNA MIAT正向引物為5′-TATTTGCAG GGGGTGCTCTG-3′，反向引物為5′-GGGCAG GGGGTCTAACTCTA-3′，擴增長度為126 bp；GAPDH正向引物為5′-GAGCCACATCGCTCAGAACA-3′，反向引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′，擴增長度為71 bp；miR-214正向引物為5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCT-3′，反向引物為5′-ATGTGACTGCCTGTCTGTGC-3′，擴增長度為71 bp；U6正向引物為5′-CGCCACATGGCATATTGCAC-3′，反向引物為5′-CAGCCATCGGGTATGCTAT-3，擴增長度81 bp。擴增體系：cDNA 1.0 μL，正向引物 0.4 μL，反向引物 0.4 μL，2×SYBR Green Premix Dimer Eraser，并添加無核酸酶水，最終體積為 20 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共38 個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達水平。

1.3隨訪 所有患者接受正規(guī)治療，并通過門診、微信或電話進行隨訪。統(tǒng)計1年內(nèi)終點事件發(fā)生情況；每2個月進行1次，以患者因心力衰竭再次入院或全因死亡為終點事件，根據(jù)是否發(fā)生終點事件分為終點事件組及無終點事件組。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA MIAT、miR-214、BNP、LVEDD、LVEF水平比較 觀察組BNP、lncRNA MIAT、LVEDD水平明顯高于對照組，miR-214、LVEF明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA MIAT、miR-214、BNP、LVEDD、LVEF水平比較

2.2終點事件組及無終點事件組一般資料比較 隨訪1年后，依據(jù)患者1年內(nèi)是否發(fā)生終點事件分為終點事件組(28例)和無終點事件組(22例)。終點事件組及無終點事件組患者性別、吸煙史、BMI、空腹血糖、AST、ALT、LVEDD和LVEF比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。終點事件組年齡、BNP、lncRNA MIAT水平明顯高于無終點事件組，miR-214明顯低于無終點事件組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 終點事件組及無終點事件組一般資料比較或n(%)]

2.3相關(guān)性分析結(jié)果 Starbase在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA MIAT靶向miR-214存在結(jié)合位點。Pearson相關(guān)性分析顯示，CHF患者的lncRNA MIAT水平與LVEDD、BNP水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與LVEF、miR-214水平呈負相關(guān)(P<0.05)；miR-214水平與LVEDD、BNP水平呈負相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 相關(guān)性分析結(jié)果

2.4各指標對CHF患者預(yù)后的預(yù)測價值 ROC曲線分析顯示，lncRNA MIAT+miR-214 預(yù)測CHF患者預(yù)后的曲線下面積(AUC)最大，為0.890，大于BNP、miR-214單獨檢測的AUC，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各指標預(yù)測CHF患者預(yù)后價值

3 討 論

心力衰竭是世界范圍內(nèi)常見的健康問題，會導致殘疾、生活質(zhì)量和預(yù)期壽命的降低。盡管已有較多方法來處置心力衰竭，包括借助醫(yī)療器械、藥理學手段和遠程監(jiān)控技術(shù)，但心力衰竭的臨床治療效果仍然相對較差。研究顯示，多種因素與疾病的發(fā)展有關(guān)，而遺傳因素在這一過程中起著核心作用。lncRNA通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TAN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清lncRNA MIAT顯著升高，其可能是冠心病診斷和預(yù)測預(yù)后的潛在標志物。YAO等[8]研究證明，MIAT 下調(diào)可減輕動脈纖維化和動脈纖維化誘導的心肌纖維化，并靶向 miR-133a-3p調(diào)節(jié)相關(guān)功能。

本研究中，觀察組患者血漿中的lncRNA MIAT水平明顯高于對照組，且終點事件組lncRNA MIAT水平明顯高于無終點事件組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示lncRNA MIAT可能與CHF的發(fā)生和進展有關(guān)。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT水平與LVEDD呈正相關(guān)，與LVEF呈負相關(guān)，提示lncRNA MIAT水平可以反映CHF患者的心臟損傷程度。lncRNA MIAT與BNP水平呈正相關(guān)，說明lncRNA MIAT可以反映CHF患者的預(yù)后。

基因表達失調(diào)是發(fā)生CHF的常見機制，并且miRNA在CHF的代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，miR-214在CHF患者中上調(diào)并抑制轉(zhuǎn)錄因子(TF)X-box結(jié)合蛋白1(XBP1)介導的內(nèi)皮細胞血管生成。LI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214通過調(diào)節(jié)瓣膜間質(zhì)細胞的成骨分化減弱主動脈瓣鈣化。而HE等[10]研究顯示，miR-214-3p-Sufu-GLI1是一種新型調(diào)控軸，可控制干細胞和新生內(nèi)膜增生的炎性平滑肌細胞分化。另外，miR-214在各種心臟疾病中發(fā)揮作用，包括缺血性心臟病、心臟肥大、肺動脈高壓(PAH)、血管損傷后的血管生成和心力衰竭。本研究中，觀察組患者血漿miR-214水平相對于對照組明顯下調(diào)，且終點事件組miR-214水平明顯低于無終點事件組，說明miR-214可能參與CHF的發(fā)生和疾病的進展。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-214水平與LVEDD呈負相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)，提示miR-214水平與CHF患者的心臟的損傷程度有關(guān)；miR-214與BNP呈負相關(guān)，說明miR-214與CHF患者血管損傷有關(guān)。

lncRNA MIAT可能通過靶向miR-214和相關(guān)信號通路參與多種癌癥的進展。例如，lncRNA MIAT水平升高可抑制miR-214表達，促進肝細胞癌患者細胞增殖；lncRNA MIAT可通過調(diào)控miR-214的表達，影響心血管疾病患者預(yù)后。LI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT 敲低通過在動脈粥樣硬化過程中調(diào)節(jié) miR-214-3p/Caspase-1 信號傳導來減輕內(nèi)皮細胞損傷。lncRNA-MIAT 介導的 miR-214-3p 沉默是糖尿病心肌病和心臟纖維化發(fā)生的原因[12]。本研究通過Starbase在線軟件預(yù)測到lncRNA MIAT可以靶向miR-214，抑制并逆轉(zhuǎn)了miR-214 對CHF的影響。相關(guān)性分析也進一步證明lncRNA MIAT可與miR-214結(jié)合。本研究中，lncRNA MIAT、miR-214、BNP對CHF患者1年內(nèi)的預(yù)后預(yù)測具有一定的價值，但存在靈敏度或特異度較低的缺點；lncRNA MIAT+miR-214 預(yù)測預(yù)后的AUC為 0.890，靈敏度為61.4%，特異度為100.0%，AUC和特異度明顯提高，說明lncRNA MIAT+miR-214對CHF患者預(yù)后有較好的預(yù)測價值。

總之，lncRNA MIAT可以靶向miR-214調(diào)控CHF的發(fā)生和進展，對預(yù)測CHF患者預(yù)后有一定的價值，可能成為預(yù)測CHF患者預(yù)后的標志物。但由于本研究涉及的CHF相關(guān)臨床指標較少，其具體機制還不太明確，這些指標能否廣泛應(yīng)用于臨床還有待于進一步研究。