許 伶，盧佳佳，儲 晨

(1.合肥職業(yè)技術學院基礎醫(yī)學科，安徽合肥 238000；2.安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院)

近年來，人們的生活方式發(fā)生了巨大變化，不規(guī)律飲食及不良生活習慣加重，導致高脂人群數(shù)量逐年上升。高脂人群的常見特征是脂質(zhì)代謝紊亂，機體脂質(zhì)異常代謝，腎小球糖原大量沉積，誘導腎組織細胞產(chǎn)生脂質(zhì)毒性，引發(fā)腎小管纖維化，最終使得腎臟功能結構發(fā)生變化，進而造成嚴重的腎損傷[1]。

哺乳動物體內(nèi)普遍存在的沉默信息調(diào)節(jié)因子相關酶1(Sirtuin 1, SIRT1)，是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙?；揎椕?，參與了細胞多種生理活動，影響了細胞的代謝和凋亡[2]。SIRT1可通過調(diào)控機體內(nèi)PGC-1α、NF-κB等重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)組織細胞產(chǎn)生氧化應激反應和增殖，從而達到保護組織細胞的作用[3]。白藜蘆醇(Resveratrol, RSV)具有抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡的藥理作用，對腎臟具有一定保護作用。有研究報道，RSV主要是通過激活SIRT1相關信號通路，使得細胞清除自由基，抗氧能力增強，以此減輕腎臟損傷[4]。但目前RSV對于腎臟保護的作用機制尚未明確。本文主要探究RSV介導SIRT1改善高脂小鼠腎損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級C57BL/6J小鼠30只，小鼠周齡為6周，體質(zhì)量為18～20 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，置于IVC型獨立送風隔離籠內(nèi)進行飼養(yǎng)。

1.2儀器 全自動生化儀(AU480, Beckman Coulter公司)，光學顯微鏡(CX31, OLYMPUS公司)，石蠟切片機(RM2135, LEICA公司)，實時熒光定量PCR儀(MA-6000, 蘇州雅睿生物技術有限公司)。

1.3試劑 RSV (南京澤朗植提技術有限公司)；高脂飼料(主要配方為59 %維持料、20 %蔗糖、10 %蛋黃粉、10 %豬油、1 %膽固醇，由協(xié)同生物公司提供)；肌酐ELISA試劑盒(Abcam公司)；多聚甲醛、PBS、顯影液、定影液、PVDF膜(Servicebio公司)；蘇木素(MedChemExpress公司)；伊紅(北京華邁科生物技術有限公司)；RIPA、PMSF(上海博湖生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；FN、SIRT1、GPx4、SOD2、GAPDH抗體(Abcam公司)；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒、羊抗兔IgG、濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.4方法

1.4.1造模及給藥 將小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，采用隨機數(shù)字表法將其分為對照組(CTRL組)、高脂組(HL組)、白藜蘆醇組(RSV組)三組，各10只，構建高脂小鼠模型。HL組與RSV組小鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)，RSV組小鼠給予高脂飼料的同時以RSV 5 mg/(kg·d) 進行灌胃，CTRL組給予普通飼料，持續(xù)18周。

1.4.2血脂、肌酐水平檢測 實驗結束后，取三組小鼠的血液，采用血液全自動生化儀檢測血漿中甘油三酯(Triglyceride, TG)、總膽固醇(Total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL-C)的水平，采用ELISA檢測試劑盒測定血清中肌酐(Creatinine， CRE)水平。

1.4.3腎組織形態(tài)學觀察 在取血結束后，將小鼠脫頸處死，清理腹部毛發(fā)，使用手術剪刀沿腹中線剪開，暴露腎臟，取出腎臟，并于多聚甲醛中固定24 h；固定完成后取出腎組織，采用梯度乙醇和二甲苯對組織進行脫水、透明；隨后將組織浸蠟，包埋，制作成石蠟標本；石蠟標本采用石蠟切片機制備成厚度5 μm的石蠟切片；對切片進行脫蠟、水化、分化、蘇木素-伊紅染色、脫水透明、封片后利用光學顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)學的變化。

1.4.4纖維粘連蛋白組化染色 如1.4.3所述制備腎組織5 μm的石蠟切片，將切片進行脫蠟、水化后，滴加過氧化氫以降低內(nèi)源性過氧化酶活性，浸入抗原修復液中加熱至微沸后冷卻，重復3次，血清封閉，滴加一抗纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN)(1∶200)，置入濕盒內(nèi)4 ℃過夜，PBS洗片，滴加羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，PBS洗片，加入辣根酶的鏈霉抗生物素蛋白37 ℃孵育30 min，滴加DAB顯色，采用純凈水終止顯色，蘇木精染核10 min后進行脫水、透明、封片，封片后利用顯微鏡觀察腎臟FN表達情況。

1.4.5SIRT1及抗氧化蛋白免疫印跡 (1)提取蛋白：取50 mg腎組織加入RIPA和PMSF抑制劑于勻漿器中進行裂解，勻漿物以12 000 r/min離心，取含蛋白質(zhì)的上清液備用；(2)BCA定量：制作蛋白濃度標準曲線，按照BCA法測定腎組織蛋白，計算腎組織蛋白的濃度；(3)配制凝膠：根據(jù)目標蛋白質(zhì)的分子量，配制合適濃度分離膠和濃縮膠；(4)電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育：取適量的蛋白樣品上樣，連接電源，進行電泳，采用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)模，5 %脫脂牛奶封閉液封閉1 h，一抗SIRT1(1∶2 000)，GPx4(1∶2 000)，SOD2(1∶2 000)，以GAPDH(1∶2 000)為內(nèi)參，4 ℃孵育過夜，孵育過夜后用PBS緩沖液洗膜，后加入二抗孵育1 h；(5)顯影、定影、分析：在暗室中將PVDF膜分別浸入顯影液和定影液中，根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間進行曝光顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影，掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析其光密度值。

1.4.6SIRT1及抗氧化基因的測定 取50 mg腎臟組織，采用Trizol法提取腎組織總RNA；檢測RNA的純度及濃度達到要求后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain, RT-PCR)實驗，20 μL反應體系，利用公式F=2-△△Ct計算相關SIRT1、Gpx4、MnSOD的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1三組血脂、肌酐水平比較 血脂測定結果顯示，CTRL組小鼠的TG、TC、LDL-C水平均正常；HL組小鼠的TG、TC、LDL-C水平與CTRL組相比均有升高(P<0.05)；RSV組小鼠的TG、TC、LDL-C水平與HL組相比均有下降(P<0.05)。HL組小鼠的CRE水平與CTRL組相比升高(P<0.05)，RSV組小鼠CRE的水平與HL組相比降低(P<0.05)。

表2 三組血脂、肌酐水平比較

2.2腎組織形態(tài)學變化 根據(jù)染色結果顯示，CTRL組小鼠腎臟形態(tài)結構完整，未見異常病理變化；HL組小鼠腎臟組織產(chǎn)生炎性浸潤，細胞間質(zhì)增加，可見腎小管發(fā)生嚴重纖維化，腎小球組織細胞彌漫性增生、系膜增多腫脹、基質(zhì)空泡變性；RSV組小鼠較HL組腎組織炎性浸潤區(qū)域和細胞間質(zhì)減少，腎小管纖維化程度降低，腎小球組織增生面積減小，系膜腫脹及基質(zhì)空泡樣變化明顯減輕。見圖1。

2.3腎組織FN表達 根據(jù)FN染色結果顯示，CTRL組小鼠腎組織中FN表達呈黃棕色，表達的部位主要集中在細胞間質(zhì)，HL組小鼠腎組織FN陽性表達較CTRL組增多，RSV組小鼠腎組織FN陽性表達較HL組顯著下降。見圖2。

圖1 各組小鼠腎組織形態(tài)學變化(×200)

圖2 各組小鼠免疫組化染色(×400)

2.4SIRT1及抗氧化蛋白表達 根據(jù)免疫印跡顯色結果進行統(tǒng)計分析，CTRL組小鼠腎組織中SIRT1及抗氧化蛋白GPx4、SOD2表達情況正常，HL組小鼠腎組織中SIRT1及抗氧化蛋白GPx4、SOD2表達較CTRL組顯著減少(P<0.05)，RSV組小鼠在給予RSV干預后腎組織SIRT1及抗氧化蛋白GPx4、SOD2表達增加(P<0.05)。見圖3。

2.5SIRT1及抗氧化基因表達 根據(jù)RT-PCR結果進行分析，與CTRL組相比，HL組小鼠腎組織中SIRT1、GPx4、SOD2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，與HL組相比，RSV組小鼠腎組織SIRT1、GPx4、SOD2 mRNA表達顯著增加(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組小鼠腎組織中SIRT1、GPx4和SOD2蛋白的表達

圖4 各組小鼠腎組織中SIRT1、GPx4和SOD2基因的表達

3 討論

由高脂飲食引發(fā)的肥胖，經(jīng)長期的脂質(zhì)代謝異常，誘導腎臟組織內(nèi)脂質(zhì)堆積，導致腎臟損傷，引發(fā)腎功能結構發(fā)生變化，最終形成慢性腎病[5]。SIRT1是sirtuin家族成員之一，其廣泛存在于腎臟中。相關研究表明，SIRT1可以通過抑制氧化應激反應來減緩慢性腎損傷的發(fā)展[6]。在抑制氧化應激反應中，腎組織中的抗氧化酶作用關鍵，其中GPx4與SOD起主導作用。抗氧化酶SOD2使氧化應激期間產(chǎn)生的超氧化物自由基歧化，而GPx4是一種有助于去除H2O2的同工酶，兩種酶均催化了抗氧化途徑的必要步驟[7]。大量的研究證實，RSV作為一種抗氧化劑，可以預防高尿酸血癥、糖尿病腎病和藥物誘導的腎損傷，其還是SIRT1的激活劑，主要是通過降低乙酰化底物的Km值，提高SIRT1的活性，發(fā)揮抗氧化的藥理作用[8]。

SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰酶，參與細胞的分化、增殖、凋亡等重要生命活動過程，可通過調(diào)控抗氧化酶的活性調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝。脂質(zhì)代謝異常，使得細胞內(nèi)活性氧水平升高，從而誘導氧化應激反應，最終導致腎內(nèi)皮細胞嚴重損傷。SIRT1的激活可以增加抗氧化酶的活性，降低活性氧水平，抑制機體氧化應激反應。本研究通過長期喂養(yǎng)高脂飼料構建高脂小鼠腎損傷模型，給予RSV干預治療，探究RSV對于高脂小鼠腎損傷的保護作用。研究結果提示RSV顯著降低了TG、TC、LDL-C及CRE的水平，腎組織形態(tài)得到有效改善，SIRT1及抗氧化酶GPx4、SOD2活性及其基因表達增加，表明RSV改善了脂質(zhì)代謝異常，通過激活SIRT1相關信號通路，增加抗氧化酶的活性，抑制了腎功能損傷。

綜上所述，RSV通過調(diào)控SIRT1通路促進了抗氧化途徑的活化，抗氧化酶的表達提高，抑制了腎組織氧化應激反應，使得高脂誘導的腎功能損傷得到改善，對腎臟發(fā)揮了良好的保護和預防作用，為臨床上預防治療高脂誘導的腎損傷提供參考。