楊新根王艷龍鄒波常文英侯玉趙悠悠王庭林*張健旭

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）（2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006）（3定襄縣林草事務(wù)中心，定襄 035400）（4太原海關(guān)技術(shù)中心，臨汾 043000）（5中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）（6中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生物互作卓越創(chuàng)新中心，北京 100049）

作為世界上種類和數(shù)量最多的哺乳動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物廣泛分布于家居(家棲類)和自然環(huán)境(野棲類)中(鄭智民等，2008)。一直以來(lái)，人類受到嚙齒動(dòng)物的危害涉及農(nóng)、林、牧業(yè)和衛(wèi)生保健等多個(gè)方面(Himsworthet al.,2013;Gryseelset al.,2015;Joneset al.,2017；王金枝等，2020)，為此，人類不得不應(yīng)用多種手段防控嚙齒動(dòng)物種群。1950年以來(lái)，抗凝血滅鼠劑(殺鼠靈、氯鼠靈、殺鼠醚等第一代抗凝血?jiǎng)?因其方便、安全和對(duì)環(huán)境的影響較小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用(Bentley,1972;Sadler,2004;Ishizukaet al.,2008)。然而，第一代抗凝血滅鼠劑使用后不久嚙齒類動(dòng)物開(kāi)始產(chǎn)生抗藥性(Boyle,1960;Greaves,1967;Greaves and Rennison,1973)?！俺?jí)老鼠”的出現(xiàn)促進(jìn)了第二代抗凝血滅鼠劑(溴敵隆、大隆、鼠敵克和氟鼠靈)的大量使用(Redfern and Gill,1980;Petterino and Paolo,2001;Gouloiset al.,2017)，但很快在一些國(guó)家發(fā)現(xiàn)了對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的嚙齒動(dòng)物(Roweet al.,1981;Kohnet al.,2003;Huanget al.,2011)。我國(guó)于1980年后開(kāi)始在家居和自然環(huán)境中廣泛使用抗凝血滅鼠劑(董天義，2001)，并在小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)和黃胸鼠(Rattus tanezumi)等家棲鼠種群中產(chǎn)生了抗藥性(張世炎等，2002；易建榮等，2005)，但很少有研究關(guān)注野棲類嚙齒動(dòng)物的抗藥性(Wanget al.,2008；高志祥等，2008)。

抗凝血滅鼠劑的作用機(jī)理是特異性抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物(vitamin K epoxide reductase,VKOR)，進(jìn)而阻止維生素K循環(huán)(Helgeland,1977;Thijssenet al.,2004)。2004年，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞基1(vitamin K epoxide reductase complex,subunit 1,VKORC1)被鑒定和報(bào)道(Rostet al.,2004;Liet al.,2004)，嚙齒動(dòng)物對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┛顾幮缘倪z傳機(jī)制也逐步被闡明：Vkorc1基因中核苷酸的突變可能會(huì)改變VKORC1蛋白的結(jié)構(gòu)，從而降低抗凝血?jiǎng)┡cVKOR的結(jié)合效率(Buckle,2013)。根據(jù)前人的報(bào)道，多種VKORC1氨基酸突變可導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生抗藥性，如 小 家 鼠 的Ala26Thr、Trp59Gly、Leu124Met、Leu128Ser和Tyr139Cys(Gouloiset al.,2017)，褐家鼠 的Val29Leu、Val45Ala、Arg58Gly、Leu128Arg和Tyr139Cys(Rostet al.,2004)，黃 胸 鼠 的Tyr139Cys(Huanget al.,2011)。這些研究無(wú)疑為我們開(kāi)展嚙齒動(dòng)物抗性監(jiān)測(cè)奠定了理論依據(jù)。

長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠(Cricetulus longicaudatus)主要分布在中國(guó)東部和中部，蒙古國(guó)西部和中部，俄羅斯圖瓦、貝加爾湖地區(qū)和布里亞特南部的草原和半沙漠地區(qū)(Poplavskayaet al.,2018)。長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠是我國(guó)重要的優(yōu)勢(shì)野棲鼠種，在局部區(qū)域其占比達(dá)70%以上，可使農(nóng)作物減產(chǎn)10%~15%(楊新根等，2019a)。黃胸鼠主要分布在東亞和東南亞地區(qū)，是一種常見(jiàn)的家棲鼠，也會(huì)在秋季遷移至田間危害農(nóng)作物(Guoet al.,2019)。近年來(lái)，黃胸鼠隨著物流網(wǎng)絡(luò)的日益發(fā)達(dá)已侵入南非和美國(guó)等地，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)氐纳锇踩臀锓N多樣性(Aplinet al.,2011;Bastoset al.,2011;Conroyet al.,2013)。一直以來(lái)，黃胸鼠被認(rèn)為是只分布在我國(guó)南方省份的重要害鼠，直到20世紀(jì)90年代后，該物種入侵山西、陜西、河北等地并逐漸成為家棲鼠類的優(yōu)勢(shì)種(張美文等，2000；吳海霞等，2017；楊新根等，2019b)。

鑒于抗凝血滅鼠劑在我國(guó)部分地區(qū)的大量使用，為了掌握鼠類抗藥性的本底資料，為開(kāi)發(fā)嚙齒動(dòng)物抗藥性監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)依據(jù)，本研究以山西省為研究區(qū)域(北緯34°34′~40°44′，東經(jīng)110°14′~114°33′)，在不同縣(市、區(qū))捕獲黃胸鼠和長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠樣本，對(duì)其Vkorc1基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，分析其多態(tài)性并鑒定可能與抗藥性有關(guān)的變異位點(diǎn)，以期為掌握嚙齒動(dòng)物Vkorc1基因在家居和自然環(huán)境中的適應(yīng)性進(jìn)化提供理論依據(jù)，并進(jìn)一步指導(dǎo)嚙齒動(dòng)物群落的抗性監(jiān)測(cè)和防控工作。

1 研究方法

1.1 樣本采集與處理

本研究于2016—2018年5—11月，從山西省農(nóng)田和養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣本，所有程序均遵循《中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017年修訂)。

從山西省13個(gè)縣(市、區(qū))的農(nóng)田捕獲嚙齒動(dòng)物，分別為晉城市陵川縣(LIC)，臨汾市隰縣(XIX)和永和縣(YOH)，長(zhǎng)治市沁縣(QNX)，晉中市左權(quán)縣(ZOQ)，呂梁市中陽(yáng)縣(ZHY)和離石區(qū)(LIS)，太原市婁煩縣(LOF)和陽(yáng)曲縣(YAQ)，陽(yáng)泉市盂縣(YUX)，忻州市靜樂(lè)縣(JNL)和五臺(tái)縣(WUT)，大同市渾源縣(HNY)(表1，圖1A)。以花生、核桃和蘋果為誘餌，傍晚同時(shí)放置大號(hào)捕鼠夾和捕鼠籠，次日收回。夾(籠)距為5 m，行距大于20 m，捕鼠夾(籠)數(shù)量每日不少于300個(gè)，共計(jì)5 805個(gè)。

從山西省14個(gè)縣(市、區(qū))的養(yǎng)殖場(chǎng)(養(yǎng)豬場(chǎng)和養(yǎng)雞場(chǎng))捕獲嚙齒動(dòng)物，分別為運(yùn)城市永濟(jì)市(YOJ)、LIC、臨汾市洪洞縣(HOT)、XIX、QNX、ZOQ、晉中市祁縣(QIX)、LIS、太原市小店區(qū)(XID)、LOF、YUX、WUT、朔 州 市 朔 城 區(qū)(SOC)、HNY(表1，圖1B)。以花生、核桃和蘋果為誘餌，同時(shí)放置大號(hào)捕鼠夾和捕鼠籠，次日收回。捕鼠夾(籠)至少放置2 d，每天檢查并重新更換餌料。夾(籠)距為5 m，行距和捕鼠夾(籠)數(shù)量根據(jù)采樣點(diǎn)具體情況確定，共計(jì)布夾(籠)3 860個(gè)。

圖1 長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠和黃胸鼠采集地及樣本占比(山西省).A：長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠；B：黃胸鼠.圖中采集地使用縮寫，全稱見(jiàn)表1.“×”表示未捕獲到黃胸鼠的采集地；餅狀圖表示樣本在嚙齒動(dòng)物群落中的占比，紅色表示長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠，藍(lán)色表示黃胸鼠，白色表示其他嚙齒動(dòng)物Fig.1 The sampling sites and proportions of samples(Shanxi Province).A:Cricetulus longicaudatus;B:Ruttus tanezumi.Abbreviations are used for collection sites,see table 1 for collection sites.‘×’represent the sites that R.tanezumi was not captured;pie charts represent the proportions of samples,red for C.longicaudatus,blue for R.tanezumi,and white for other species

表1 樣本采集地概況Table 1 The collecting details of sample sites

計(jì)算每個(gè)縣(市、區(qū))不同采樣生境(農(nóng)田或養(yǎng)殖場(chǎng))的捕獲率：農(nóng)田或養(yǎng)殖場(chǎng)捕獲率(%)=捕獲農(nóng)田或養(yǎng)殖場(chǎng)嚙齒動(dòng)物總個(gè)體數(shù)/農(nóng)田或養(yǎng)殖場(chǎng)布夾(籠)數(shù)×100；計(jì)算長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠或黃胸鼠在嚙齒動(dòng)物群落中的占比：長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠或黃胸鼠占比(%)=捕獲長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠或黃胸鼠數(shù)/捕獲農(nóng)田或養(yǎng)殖場(chǎng)嚙齒動(dòng)物總個(gè)體數(shù)。

剪取每只長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠和黃胸鼠個(gè)體的尾尖并放置于無(wú)水乙醇中，-80℃冰箱儲(chǔ)存，以備提取基因組DNA。

1.2 DNA提取

每個(gè)樣本基因組DNA的提取根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根，DP304)的使用說(shuō)明書進(jìn)行。DNA提取物在TE緩沖液中洗脫并儲(chǔ)存在-20℃環(huán)境中。

1.3 物種鑒別

首先應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行物種的鑒別(鄭智民等，2008)。在此基礎(chǔ)上，采用基于細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(cytochrome c oxidase subunit I,COI)的DNA條形碼技術(shù)以避免錯(cuò)誤鑒別(Hebertet al.,2003)：應(yīng)用通用引物BatL5310(5′-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3′)和R6036R(5′-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3′)從每個(gè)樣本的基因組DNA中擴(kuò)增COI基因片段，PCR(BioR Technology,G1000)反應(yīng)體系包括1.5 μL基因組DNA模板(30~50 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(天根，KT201)，9 μL雙蒸水和上下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，54℃退 火1 min，72℃延 伸1 min，循 環(huán)35次；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

應(yīng)用MEGA X軟件包中的Muscle軟件，對(duì)測(cè)序所得COI序列與已發(fā)表長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠COI序列(GenBank編號(hào)KC709682.1)和黃胸鼠COI序列(GenBank編號(hào)NC_011638.1)進(jìn)行比對(duì)(Edgar,2004)，COI序列差異度小于2%為同一物種(Hebertet al.,2003)。

1.4 Vkorc1基因擴(kuò)增與測(cè)序

鑒于Vkorc1基因共含有3個(gè)外顯子，本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的灰倉(cāng)鼠(Cricetulus griseus)(長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠的近緣種)和黃胸鼠Vkorc1基因序列(GenBank編號(hào)分別為NC_048596.1和FJ868832.1)，分別設(shè)計(jì)了兩組引物(表2)。所有Vkorc1基因的擴(kuò)增均在PCR儀(BioR Technology,G1000)中進(jìn)行，反應(yīng)體系含有1.5 μL基因組DNA模板(30~50 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(天根，KT201)，9 μL雙蒸水和上下游引物各1 μL。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠第一組引物C.l.-Vk1/F/e1-2和C.l.-Vk1/R/e1-2用于將Vkorc1基因從核苷酸(-)113[Vkorc1基因外顯子1中的第一個(gè)核苷酸編號(hào)為(+)1，黃胸鼠同]擴(kuò)增至核苷酸(+)1231(包含外顯子1和2)，第二組引物C.l.-Vk1/F/e3和C.l.-Vk1/R/e3用于將Vkorc1基因從核苷酸(+)1810擴(kuò)增至核苷酸(+)2316(包含外顯子3)(表2)。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃(第一組引物)或60℃(第二組引物)退火30 s，72℃延伸100 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min。

對(duì)于黃胸鼠，第一組引物R.t.-Vk1/F/e1-2和R.t.-Vk1/R/e1-2用于將Vkorc1基因從核苷酸(-)167擴(kuò)增至核苷酸(+)1278(包含外顯子1和2)，第二組引物R.t.-Vk1/F/e3和R.t.-Vk1/R/e3用于將Vkorc1基因從核苷酸(+)1789擴(kuò)增至核苷酸(+)2175(包含外顯子3)(表2)。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃(第一組引物)或60℃(第二組引物)退火30 s，72℃延伸100 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min。

表2 長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠和黃胸鼠Vkorc1基因編碼區(qū)的特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences for the coding regions of Vkorc1 of Cricetulus longicaudatus and Ruttus tanezumi

1.5 Vkorc1基因變異位點(diǎn)檢測(cè)

應(yīng)用MEGA X軟件包中的Muscle軟件(Edgar,2004)，分 別 以 灰 倉(cāng) 鼠(GenBank編 號(hào)NC_048596.1)和黃胸鼠(GenBank編號(hào)FJ868832.1)Vkorc1基因序列為參考，比對(duì)擴(kuò)增成功的長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠和黃胸鼠Vkorc1基因外顯子序列，手動(dòng)檢測(cè)并記錄Vkorc1基因編碼區(qū)的變異位點(diǎn)，計(jì)算攜帶不同變異位點(diǎn)的個(gè)體在種群中的占比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0對(duì)不同錯(cuò)義突變位點(diǎn)的分布頻數(shù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，比較錯(cuò)義突變位點(diǎn)在不同縣(市、區(qū))的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 捕獲率及樣本占比

本研究共在山西省的18個(gè)縣(市、區(qū))捕獲嚙齒動(dòng)物613只(表3)。在農(nóng)田和果園中，共捕獲511只嚙齒動(dòng)物(未捕獲到黃胸鼠)，LIS捕獲率最低(6.85%)，XIX最高(14.77%)；在養(yǎng)殖場(chǎng)共捕獲102只家棲類嚙齒動(dòng)物，HNY捕獲率最低(0.37%)，LIC最高(7.22%)(表3)。

經(jīng)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒別后，長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠在采樣的13個(gè)縣(市、區(qū))的農(nóng)田中均有捕獲，共捕獲119只個(gè)體，占野棲類嚙齒動(dòng)物的23.29%，表明該物種在農(nóng)田中的優(yōu)勢(shì)鼠種地位(表3，圖1A)。在采樣的山西省14個(gè)縣(市、區(qū))的養(yǎng)殖場(chǎng)中，黃胸鼠呈條帶狀分布，共在8個(gè)縣(市、區(qū))有所捕獲，分別為YOJ、LIC、HOT、QNX、QIX、LIS、XID和WUT，而 在XIX、ZOQ、LOF、YUX、SOC和HNY未捕獲到黃胸鼠；共捕獲黃胸鼠個(gè)體70只，占家棲類嚙齒動(dòng)物的68.63%，表明該物種在分布區(qū)域的優(yōu)勢(shì)種地位(表3，圖1B)。

表3 嚙齒動(dòng)物捕獲率及樣本占比Table 3 The sampling sites and the trapping details of rodents

2.2 Vkorc1基因變異位點(diǎn)

本研究共獲得105只長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠個(gè)體Vkorc1基因3個(gè)外顯子的全序列，在外顯子中共檢測(cè)到11個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(表4)。其中，沉默突變位點(diǎn)有6個(gè)，分別是外顯子1中的G78A(C)(Ala26Ala)、G135A(Val45Val)和C159A(Arg53Arg)，外顯子2中的C222T(Ser74Ser)，外顯子3中的C342T(Phe114 Phe)和C438T(His146His)；有5個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，分別為外顯子1中的C8T(Thr3Ile)和G106A(Asp36Asn)，外 顯 子2中 的A203G(His68Arg)和A203T(His68Leu)，外顯子3中的G346A(Gly116 Ser)(表4)。在沉默突變位點(diǎn)中，外顯子3中C438T(His146His)的變異率最高，為67.62%，其次為C342T(Phe114Phe)的28.57%，外顯 子1中 的G135A(Val45Val)變異率最低，為8.57%(表4)。在錯(cuò)義突變位點(diǎn)中，檢測(cè)到10只長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠個(gè)體有錯(cuò)義突變A203G(His68Arg)，突變率為9.52%；9只個(gè)體(8.57%)檢測(cè)到C8T(Thr3Ile)；3只個(gè)體(2.86%)有G106A(Asp36Asn)；2只個(gè)體(1.90%)有A203T(His68Leu)；1只個(gè)體有G346A(Gly116Ser)(表4)。

獲得70只黃胸鼠個(gè)體Vkorc1基因3個(gè)外顯子的全系列，在外顯子中共檢測(cè)到7個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(表4)。其中6個(gè)為沉默突變位點(diǎn)，分別為外顯子1中 的A36G(Arg12Arg)和G123A(Ala41Ala)，外 顯 子2中 的T204C(His68His)和A246T(Ile82Ile)，外 顯 子3中 的A321C(Ile107Ile)和T411C(Thr137Thr)(表4)；錯(cuò)義突變位點(diǎn)有1個(gè)，為外顯子3中的A416G導(dǎo)致氨基酸變異Tyr139Cys(表4)。在所有沉默突變位點(diǎn)中，變異率最高的為外 顯 子3中 的A321C(Ile107Ile)和T411C(Thr137Thr)，變異率為18.57%；變異率最低的為外顯子2中的A246T(Ile82Ile)，僅檢測(cè)到3只個(gè)體(4.29%)(表4)。共在8只個(gè)體中檢測(cè)到錯(cuò)義突變位點(diǎn)A416G(Tyr139Cys)，變異率為11.43%(表4)。

表4 長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠和黃胸鼠Vkorc1編碼區(qū)變異位點(diǎn)Table 4 The mutation positions in coding regions of Vkorc1 gene of Cricetulus longicaudatus and Ruttus tanezumi

分析不同錯(cuò)義突變位點(diǎn)在各縣(市、區(qū))分布頻數(shù)的差異性。在長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠種群中，錯(cuò)義突變位點(diǎn)C8T(Thr3Ile)在不同縣(市、區(qū))的分布頻數(shù)有顯著差異(P=0.003)，其中，該突變?cè)贚IC和HNY的分布頻數(shù)顯著高于其他縣(市、區(qū))；位點(diǎn)G106A(Asp36Asn)的分布頻數(shù)無(wú)顯著差異(P=0.349)；位點(diǎn)A203G(His68Arg)的分布頻數(shù)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，其在LIC的分布頻數(shù)顯著高于其他縣(市、區(qū))；位點(diǎn)A203T(His68Leu)在不同縣(市、區(qū))的分布頻數(shù)有顯著差異(P=0.015)，其在XIX的分布頻數(shù)顯著高于其他縣(市、區(qū))；位點(diǎn)G346A(Gly116Ser)的分布頻數(shù)在不同縣(市、區(qū))無(wú)顯著差異(P=0.530)。在黃胸鼠種群中，錯(cuò)義突變位點(diǎn)A416G(Tyr139Cys)的分布頻數(shù)在不同縣(市、區(qū))有顯著差異(P=0.019)，其中，該位點(diǎn)在XID和QIX的分布頻數(shù)無(wú)顯著差異(P=0.528)，在XID的分布頻數(shù)顯著高于除QIX外的其他縣(市、區(qū))。

2.3 攜帶變異位點(diǎn)樣本的分布

分析攜帶Vkorc1基因變異位點(diǎn)的長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠個(gè)體在各采樣地的分布，所有13個(gè)采樣地的個(gè)體均含有Vkorc1基因變異位點(diǎn)，其中，LIC、XIX、ZOQ、ZHY、LOF、YAQ、YUX和HNY的樣本含有錯(cuò)義突變個(gè)體，YOH、QNX、LIS、JNL和WUT的樣本只含有沉默突變位點(diǎn)，僅檢測(cè)到來(lái)自YOH、QNX、YUX、LOF和JNL的10個(gè)非變異樣本(圖2)。在含有錯(cuò)義突變個(gè)體的采樣地中，LIC的樣本錯(cuò)義突變率最高，為71.43%，其次為XIX樣本的37.50%(圖2)。

圖2 長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠不同類型Vkorc1基因變異個(gè)體在各采樣地的變異率.NM：無(wú)變異位點(diǎn)；SM：含沉默突變位點(diǎn)；MM：含錯(cuò)義突變位點(diǎn)Fig.2 The mutation rate of Vkorc1 mutatants about Cricetulus longicaudatus in each sampling sites.NM:Non-mutatants;SM:Silent mutatants;MM:Missense mutatants

變異率最高的沉默突變C438T(His146His)共出現(xiàn)在71個(gè)樣本中，且在所有13個(gè)采樣地均有分布。共在17個(gè)樣本中檢測(cè)到錯(cuò)義突變，其中，LIC的1個(gè) 樣 本 同 時(shí) 含 有Thr3Ile、Asp36Asn和His68Arg 3種雜合錯(cuò)義突變位點(diǎn)，LIC的2個(gè)樣本、HNY的2個(gè) 樣 本、ZOQ的1個(gè)樣本和ZHY的1個(gè)樣本同時(shí)含有Thr3Ile和His68Arg 2種錯(cuò)義突變位點(diǎn)。Thr3Ile的變異體來(lái)自6個(gè)采樣地(LIC、XIX、ZOQ、ZHY、YAQ和HNY)，Asp36Asn的3個(gè)突變體分別來(lái)自LIC、ZOQ和LOF，His68Arg的變異體來(lái)自5個(gè)采樣地(LIC、XIX、ZOQ、ZHY和HNY)，His68Leu僅 在XIX檢 測(cè) 到，Gly116Ser僅出現(xiàn)在YUX。

黃胸鼠樣本中，除YOJ、LIC和QNX外，在HOT、QIX、LIS、XID和WUT中共檢測(cè)到22個(gè)樣本存在Vkorc1基因變異位點(diǎn)，占31.43%。在XID的樣本中，檢測(cè)到所有的7個(gè)變異位點(diǎn)，在QIX共檢測(cè)到5個(gè)，在HOT、LIS和WUT中檢測(cè)到4個(gè)。對(duì)于錯(cuò)義突變Tyr139Cys，8個(gè)變異體中有7個(gè)來(lái)自XID，1個(gè)來(lái)自QIX，其變異率分別為35.00%和16.67%(圖3)。

圖3 黃胸鼠不同類型Vkorc1基因變異個(gè)體在各采樣地的變異率.NM：無(wú)變異位點(diǎn)；SM：含沉默突變位點(diǎn)；MM：含錯(cuò)義突變位點(diǎn)Fig.3 The mutation rate of Vkorc1 mutatants about Ruttus tanezumi in each sampling sites.NM:Non-mutatants;SM:Silent mutatants;MM:Missense mutatants

3 討論

在山西省，因長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠在農(nóng)田的優(yōu)勢(shì)種地位(本研究13個(gè)采樣點(diǎn)均有捕獲，相對(duì)占比23.29%)，成為了抗凝血滅鼠劑在農(nóng)田化學(xué)防治工作中的重要靶標(biāo)物種(楊新根等，2019a)。20世紀(jì)90年代之前，黃胸鼠僅分布于長(zhǎng)江以南諸省，與農(nóng)業(yè)和公共衛(wèi)生均密切相關(guān)(張美文等，2004)。近年來(lái)，黃胸鼠的持續(xù)北擴(kuò)可能與氣候變暖和物流網(wǎng)絡(luò)的高速發(fā)展有密切關(guān)系，使我們不得不擔(dān)心其對(duì)公共衛(wèi)生和生物安全的影響(Plyusninaet al.,2009;Blasdellet al.,2011;Huanget al.,2013)。從采樣結(jié)果看，黃胸鼠現(xiàn)階段呈條帶狀分布于五臺(tái)縣以南的家居環(huán)境中，這可能與黃胸鼠借助交通工具的擴(kuò)散方式有關(guān)，加之需逐步適應(yīng)北方的低溫環(huán)境，因此在山西省其很少對(duì)農(nóng)作物造成危害。另外，在山西省黃胸鼠已占家棲類嚙齒動(dòng)物的68.63%，在其分布區(qū)域處于明顯優(yōu)勢(shì)種地位，已對(duì)當(dāng)?shù)卦覘悋X動(dòng)物(褐家鼠和小家鼠)造成了較大的威脅。在我國(guó)，抗凝血滅鼠劑用于室內(nèi)和田間鼠害防治已有近40年的歷史(董天義，2001)，然而，抗藥性嚙齒動(dòng)物的出現(xiàn)嚴(yán)重阻礙了該類滅鼠劑的有效性。抗凝血滅鼠劑的大量使用對(duì)生態(tài)系統(tǒng)也有很大影響。有研究表明，抗凝血滅鼠劑對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物具有較高的暴露風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)?dǎo)致抗藥性(Christensenet al.,2012;Geduhnet al.,2016;St?cket al.,2019)。

Vkorc1基因的核苷酸變異改變了嚙齒動(dòng)物對(duì)抗凝血滅鼠劑的反應(yīng)，因此，其變異位點(diǎn)常被用作檢測(cè)和監(jiān)測(cè)抗藥性嚙齒動(dòng)物的分子標(biāo)記(Díazet al.,2010)。研究表明，在農(nóng)田中較低的選擇壓力、較低的空間藥劑濃度及其棲息環(huán)境的易變性，使嚙齒類動(dòng)物的抗藥性通常很難在田間檢測(cè)到(Buckle and Smith,1994)，但毋庸置疑，抗凝血滅鼠劑的長(zhǎng)期使用使野外嚙齒類動(dòng)物對(duì)其產(chǎn)生抗性(Veinet al.,2011)。本研究在長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠Vkorc1基因編碼區(qū)共檢測(cè)到11種不同的變異位點(diǎn)，包括5個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)和6個(gè)沉默突變位點(diǎn)。研究證實(shí)錯(cuò)義突變位點(diǎn)His68Asn會(huì)導(dǎo)致黑家鼠(Rattus rattus)的Ki催化活性降低(Marquezet al.,2019)，本文在長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠Vkorc1基因檢測(cè)到的5種錯(cuò)義突變位點(diǎn)Thr3Ile、Asp36Asn、His68Arg、His68Leu和Gly116Ser是否與抗藥性有關(guān)，還需從酶動(dòng)力學(xué)、蛋白結(jié)構(gòu)與功能等生化領(lǐng)域深入研究和闡明，以評(píng)估其編碼的VKORC1酶對(duì)抗凝血滅鼠劑的敏感性。但不可否認(rèn)，高頻率用藥的縣(市、區(qū))常具有Vkorc1基因的高突變率：在LIC和XIX(兩縣曾持續(xù)多年應(yīng)用抗凝血滅鼠劑對(duì)農(nóng)田害鼠進(jìn)行高頻率防控)，錯(cuò)義突變位點(diǎn)Thr3Ile(LIC)、His68Arg(LIC)和His68Leu(XIX)的分布頻率顯著高于其他縣(市、區(qū))。

錯(cuò)義突變A416G(Tyr139Cys)是檢測(cè)抗藥性的重要分子標(biāo)記之一，在對(duì)殺鼠靈和溴敵隆產(chǎn)生抗性的小家鼠、黃胸鼠、黑家鼠和褐家鼠中已有報(bào)道(Pelzet al.,2005;Huanget al.,2011;Gouloiset al.,2017)。139位點(diǎn)上的氨基酸突變被認(rèn)為是疏水性Thr-Tyr-Ala(138-139-140)序列中結(jié)合抗凝血滅鼠劑的關(guān)鍵位置(Rostet al.,2005)。本研究在黃胸鼠種群中檢測(cè)到的7個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，包括6個(gè)沉默突變位點(diǎn)和1個(gè)Tyr139Cys錯(cuò)義突變位點(diǎn)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，8只出現(xiàn)了A416G(Tyr139Cys)變異位點(diǎn)的黃胸鼠已對(duì)抗凝血滅鼠劑產(chǎn)生了抗藥性，其中，QIX的6只黃胸鼠樣本中的1只存在A416G(Tyr139Cys)變異位點(diǎn)，因樣本量較小，尚無(wú)法確定QIX是否存在黃胸鼠的抗性種群；XID種群中7只個(gè)體存在A416G(Tyr139Cys)變異位點(diǎn)，占比達(dá)35.00%，說(shuō)明在XID已經(jīng)產(chǎn)生了黃胸鼠抗性種群，需加強(qiáng)對(duì)此種群的監(jiān)測(cè)(董天義，2001)。

盡管沉默突變不會(huì)影響VKORC1蛋白酶的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)，也不影響嚙齒動(dòng)物的抗藥性，但目前尚無(wú)法確定這些沉默突變是否會(huì)影響其翻譯效率，以及是否與藥物選擇下的基因進(jìn)化有關(guān)(Andruet al.,2013)。在本研究檢測(cè)到的沉默突變中，長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠變異率最高的為C438T(His146His)(外顯子3)，占67.62%，黃胸鼠最常見(jiàn)變異位點(diǎn)為A321C(Ile107Ile)和T411C(Thr137Thr)(外顯子3)，變異率為18.57%(表4)。這些沉默突變位點(diǎn)是否與大量使用抗凝血滅鼠劑有關(guān)，尚待在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

自然界中一些嚙齒動(dòng)物具有天然抗性，但更多的嚙齒動(dòng)物是后天在抗凝血類滅鼠劑的選擇脅迫下產(chǎn)生的適應(yīng)性抗性。人類雖然在嚙齒動(dòng)物Vkorc1基因多態(tài)性研究方面取得了一些成果，但相對(duì)于龐大的嚙齒動(dòng)物群落而言，仍需要廣大科研工作者的持續(xù)關(guān)注和研究。

綜上，本研究通過(guò)分析長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠和黃胸鼠種群Vkorc1基因的多態(tài)性，明確了山西省長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠種群中存在5種錯(cuò)義突變，這些錯(cuò)義突變是否與長(zhǎng)尾倉(cāng)鼠的抗藥性有關(guān)，需進(jìn)一步地深入研究和闡明；黃胸鼠中存在與其抗藥性密切相關(guān)的A416G(Tyr139Cys)錯(cuò)義突變，且已在太原市小店區(qū)形成抗性種群，需加強(qiáng)對(duì)此種群的監(jiān)測(cè)；鑒于沉默突變?cè)趦晌锓N中的高變異率，其是否與藥物選擇下的基因進(jìn)化有關(guān)，尚待在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究可以為開(kāi)發(fā)嚙齒動(dòng)物抗藥性監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)資料，進(jìn)一步為嚙齒動(dòng)物的監(jiān)測(cè)預(yù)警和科學(xué)制定區(qū)域性綜合防控措施提供理論依據(jù)。