蔣葉坷，陳燕，潘凌宇，韓燕全，何寧，汪永忠*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，安徽 合肥230031. 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)損傷、持續(xù)性滑膜炎為主要表現(xiàn)特征的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[1]，慢性炎癥形成侵襲性血管翳和滑膜組織腫瘤樣增生是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的重要特征之一[2]。據(jù)估計(jì)，全球類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的平均患病率在0.5%～1.0%之間[3]。目前臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的西藥主要用于減輕癥狀，長期使用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，包括嘔吐、皮疹、白細(xì)胞減少和肝腎損傷[4]。因此，迫切需要找到高效低毒的藥物來改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療和長期預(yù)后。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”范疇，其中，風(fēng)寒濕邪，經(jīng)絡(luò)不暢、痰瘀互結(jié)是導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的病機(jī)關(guān)鍵。故類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療亦遵循祛風(fēng)除濕、散寒通絡(luò)、扶正祛邪、祛痰化瘀、清熱利濕、活血通絡(luò)的治則[5]。中藥防治疾病具有多靶點(diǎn)、多通路的整體調(diào)理的治療原則，使其臨床療效顯著。

威靈仙具有祛風(fēng)濕、消痰涎、通經(jīng)絡(luò)、解散癖積之作用，被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎、腰膝疼痛、肢體麻木等疾病。威靈仙中主要含有皂苷、黃酮、木脂素、酚類、生物堿、揮發(fā)油等化學(xué)成分[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，威靈仙皂苷類成分是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要成分，Xiong等[7]研究發(fā)現(xiàn)威靈仙三萜皂苷類化合物靈仙新苷(clematichinenoside AR)可能通過抑制p38和ERK MAPKS信號通路來降低TNF-α刺激的人成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A中IL-6和IL-8的分泌。柳清等[8]采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測威靈仙總皂苷(TSC)對AA大鼠血清代謝譜的變化，發(fā)現(xiàn)TSC對AA大鼠的治療作用可能與調(diào)節(jié)脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝有關(guān)。目前關(guān)于威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究主要集中于相關(guān)化學(xué)成分的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，有關(guān)藥效機(jī)制的研究相對較少。因此，應(yīng)該進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。因網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究具有的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與現(xiàn)代中醫(yī)藥對于疾病治療的整體觀、辯證理論相適應(yīng)和契合[9]，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來研究威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，為威靈仙的后期研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

所用在線數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)址見表1，Cytoscape3.7.1為網(wǎng)絡(luò)分析軟件， AutoDock Vina 1.5.6為分子對接軟件，PyMOL軟件將分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究數(shù)據(jù)庫

1.2 威靈仙活性成分與作用靶點(diǎn)的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine Systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫中，以“威靈仙”為檢索詞，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug-like index, DL)≥0.18，獲取威靈仙的活性成分，補(bǔ)充《中國藥典》中未能符合篩選標(biāo)準(zhǔn)但含量高的活性成分齊墩果酸。使用PubChem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測威靈仙活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索“rheumatoid arthritis”篩選得到與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，Relevance score值越大，則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切，若靶點(diǎn)過多，參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，選擇Relevance score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)合并、刪除重復(fù)值得到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)。

1.4 獲取交集靶點(diǎn)并構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

用在線畫圖工具Venny2.1.0構(gòu)建維恩圖，確定威靈仙活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)。用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)“度值(degree)大于均值篩選威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置交互分?jǐn)?shù)>0.400，物種為“Homo sapiens”，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(proteinprotein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行“Network Analyzer”分析，篩選度值、介數(shù)(betweenness centrality)均大于平均值的節(jié)點(diǎn)為威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)[11]。

1.6 GO分析與KEGG通路分析

將獲取的交集靶點(diǎn)輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)置標(biāo)識符為“OFFICIAL GENE SYMBOL”、物種選擇為“Homo sapiens”，其余保持默認(rèn)，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析?？梢暬疨<0.05的通路，利用微生信平臺繪制GO功能富集和KEGG通路富集圖。

1.7 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.4項(xiàng)得到的交集靶點(diǎn)與相應(yīng)活性成分，結(jié)合1.6項(xiàng)下得到的KEGG通路富集分析結(jié)果，通過Cytoscape3.7.1構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 分子對接驗(yàn)證

在ZINC數(shù)據(jù)庫中獲取關(guān)鍵活性成分的3D分子結(jié)構(gòu)mol2文件，PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)的PDB Format格式文件。采用AutoDock Tools軟件對核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫、并計(jì)算其電荷，最后轉(zhuǎn)換為pdbqt受體格式，將小分子加全氫、檢測扭轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)換為pdbqt配體格式。AutoDock Vina1.5.6軟件進(jìn)行分子對接，PyMOL軟件對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 威靈仙主要活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)設(shè)置的條件初步篩選出7個(gè)成分，去除1個(gè)未找到靶點(diǎn)的成分，根據(jù)《中國藥典》補(bǔ)充不滿足篩選條件但含量較高的成分齊墩果酸，最終確定7個(gè)成分，結(jié)果見表2。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫收集Probability大于0的靶點(diǎn)，共收集到251個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后得到104個(gè)靶點(diǎn)。

表2 威靈仙的活性成分

2.2 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

通過查詢GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)經(jīng)過篩選、刪除重復(fù)值后共得到1 592個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)。

2.3 獲取交集靶點(diǎn)并構(gòu)建威靈仙活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將威靈仙的104個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)與1 592個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0作圖平臺，獲得威靈仙作用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)37個(gè)，見圖1。使用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建威靈仙活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)包含46個(gè)節(jié)點(diǎn)(7個(gè)威靈仙活性成分節(jié)點(diǎn)，37個(gè)交集靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，1個(gè)威靈仙節(jié)點(diǎn)和1個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎節(jié)點(diǎn))，104條邊，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1，使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分為齊墩果酸、3-表齊墩果酸、豆甾醇、β-谷甾醇。

圖1 威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)Fig.1 The potential targets of Clematidis Radix Rhizoma in the treatment of rheumatoid arthritis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點(diǎn)的篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析及可視化展示，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2。網(wǎng)絡(luò)中共有36個(gè)節(jié)點(diǎn)，122條邊，各節(jié)點(diǎn)的平均度值為6.75，平均介數(shù)為0.034，節(jié)點(diǎn)的大小與顏色表示度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深、度值越大的靶點(diǎn)為威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的重要靶點(diǎn)。推測MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、NR3C1、ALOX5靶點(diǎn)可能是威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3。

2.5 GO和KEGG富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對威靈仙活性成分與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果得到GO條目145條，包括生物過程(biological process , BP)94條，主要與轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子,類固醇激素介導(dǎo)的信號通路,對脂多糖、炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控,氧化還原過程,炎癥反應(yīng),環(huán)氧合酶途徑,脂氧合酶途徑,前列腺素生物合成的過程等功能有關(guān)；細(xì)胞組成(cell component , CC)得到12條，主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞核、核漿、細(xì)胞器膜、核膜、核膜內(nèi)腔、質(zhì)膜等有關(guān)；分子功能(molecular function , MF)得到39條，主要與類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、酶結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合、非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶活性、鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性，RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合等功能有關(guān)，將P< 0.05且排名前10的BP、CC、MF通過微生信平臺作圖，結(jié)果見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4。

KEGG通路分析獲得22條信號通路，主要涵蓋了花生四烯酸代謝通路、卵巢類固醇生成、催乳素信號通路、甾體類激素生物合成、含血清素的神經(jīng)突觸、利什曼病、炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)、雌激素信號通路、神經(jīng)活性受體-配體相互作用、癌癥通路等，利用微生信平臺將P<0.05的前10條通路作氣泡圖，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5所示。

2.6 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件將P值排名前10的通路與活性成分、交集靶點(diǎn)構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路圖，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖6。

2.7 分子對接驗(yàn)證

為明確核心靶蛋白與相應(yīng)的活性成分之間的結(jié)合活性，以關(guān)鍵活性成分齊墩果酸、3-表齊墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇作為配體，核心靶點(diǎn)MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、NR3C1、ALOX5作為受體，AutoDock Vina1.5.6軟件進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表3。結(jié)合能評判小分子與蛋白的相互作用強(qiáng)度，結(jié)合能越低，表明兩者結(jié)合越穩(wěn)定，小分子與蛋白的最低結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol[12]，說明藥物成分與靶點(diǎn)具有強(qiáng)結(jié)合力。分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol，說明威靈仙對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有治療效果。齊墩果酸與3-表齊墩果酸是度值排名前兩位的關(guān)鍵成分，MAPK3與PTGS2是篩選出的排名前兩位的核心靶點(diǎn)，因此認(rèn)為齊墩果酸與3-表齊墩果酸作用于MAPK3、PTGS2是威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵，對接結(jié)果顯示其具有較好的結(jié)合活性，初步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘的結(jié)果，Pymol軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖2。

表3 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的對接結(jié)果

表3(續(xù))

注：ARG代表精氨酸；GLY代表甘氨酸；SER代表絲氨酸；LEU代表亮氨酸。圖2 威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)對接圖Fig.2 Docking diagram of key active ingredients and core targets of Clematidis Radix Rhizoma in the treatment of rheumatoid arthritis

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的分子機(jī)制，通過GO和KEGG富集分析得到威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的分子功能、生物過程、作用通路。通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖和拓?fù)浞治龊Y選得到齊墩果酸、3-表齊墩果酸、豆甾醇、β-谷甾醇關(guān)鍵活性成分，其核心靶點(diǎn)為MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、NR3C1、ALOX5。分子對接初步驗(yàn)證了結(jié)果，說明威靈仙可能通過作用于以上的靶點(diǎn)和通路發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

分析結(jié)果表明，威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分為齊墩果酸、3-表齊墩果酸、豆甾醇、β-谷甾醇。成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)增殖和炎癥因子分泌是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要病理特征，研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸及其衍生物具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，齊墩果酸可能通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞炎癥因子的分泌來發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[13]，其衍生物能減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥[14]。豆甾醇能明顯降低LPS誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2(COX-2)的蛋白和mRNA表達(dá)水平，減少前列腺素E2(PGE2)的釋放，發(fā)揮抗炎作用[15]。β-谷甾醇固體脂質(zhì)納米粒通過抑制NF-kB和激活HO1/Nrf-2通路發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎的作用[16]。提示上述成分可能是威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過PPI分析并構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，篩選得到MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、ALOX5、NR3C1 6個(gè)核心蛋白。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號通路包括ERK1/2、JNK1/2/3、p38-MAPK和ERK5。MAPK參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、遷移、凋亡[17]，MAPKs已被證實(shí)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，激活MAPKs可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和關(guān)節(jié)炎癥。研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中MAPKs的表達(dá)異常增加，促進(jìn)滑膜增殖。因此，MAPK被認(rèn)為是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有前途的潛在治療靶點(diǎn)[18]。

前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)又稱環(huán)氧化酶(COX)，有PTGS1和PTGS2兩種亞型，環(huán)氧化酶是前列腺素生物合成中必不可少的限速酶[19]，在正常生理?xiàng)l件下，PTGS2低水平表達(dá)。然而，在炎癥部位促炎因子的誘導(dǎo)下，PTGS2可以從單核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中大量釋放，參與炎癥過程，造成機(jī)體損傷[20]。CYP19A1是細(xì)胞色素P450超家族的成員，他們是催化類固醇生成中許多反應(yīng)的單加氧酶，又稱芳香酶。在RA患者的滑膜組織中，巨噬細(xì)胞參與了外周性激素代謝，這與p450芳香化酶(CYP19A1基因編碼)的局部作用有關(guān)[21]。

花生四烯酸代謝通路是威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵通路，同時(shí)也是炎癥反應(yīng)的重要通路，花生四烯酸(AA)是一種多不飽和-6脂肪酸，主要作為磷脂的組成部分存在。在炎癥刺激下，AA可通過胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)釋放，并通過代謝產(chǎn)生類二十五烷家族[22-23]，前列腺素和白三烯是這個(gè)家族中的兩個(gè)重要成員，參與穩(wěn)態(tài)生物功能和炎癥[24]

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對威靈仙治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制進(jìn)行了初步的探索，結(jié)果表明威靈仙通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，為其進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。