胡廣艷,趙忠娟,b，楊合同，b*

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) a.生態(tài)研究所；b.山東省應用微生物重點實驗室 山東 濟南 250103)

鹽脅迫作為最常見的非生物脅迫之一，能顯著降低植物的產(chǎn)量并影響植物生理生化各方面的指標[1]。據(jù)統(tǒng)計，土壤鹽漬化問題已經(jīng)涉及了全球20%的耕地和33%的灌溉農(nóng)田，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，成為了世界范圍內(nèi)的一個重要農(nóng)業(yè)問題[2-3]。我國黃河三角洲地區(qū)土壤鹽漬化范圍廣，面積大，嚴重制約了該地區(qū)的土地利用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤中存在的有益微生物能夠促進植物對非生物脅迫的耐受性，改善植物生長發(fā)育[4]。因此對植物進行微生物處理，尋找合適的植物-微生物組合，以此促進植物生長及植物抗脅迫能力，對作物生產(chǎn)具有重要意義[5]。

木霉菌是目前研究和應用最為廣泛的生防真菌之一，是一類重要的植物根際促生真菌，可以促進植物生長、提高植物抗逆性、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。目前木霉菌已經(jīng)開發(fā)為微生物菌劑，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐[6]。目前國內(nèi)外己經(jīng)有50多種木霉商品化制劑[7],如美國的哈茨木霉T22菌株,俄羅斯的木霉制劑Myc01[8]等，在不同地區(qū)都取得了良好的作用效果。Huang等[9]將哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SQR-T37制成生物菌肥，發(fā)現(xiàn)該生物菌肥對黃瓜立枯病的防效達到了81.82%；趙遠征等[10]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉可濕性粉劑對馬鈴薯黑痣病有防治效果和增產(chǎn)效果。但是，目前對于耐鹽木霉菌株微生物制劑的研究和報道較少。

針對黃河三角洲鹽漬化土壤中植物生長困難的問題，山東省科學院生態(tài)研究所分離多株具有較高耐鹽活性的木霉菌株[11]，其中深綠木霉(T.atroviride)TW320和擬康寧木霉(T.koningiopsis)TW1876的耐鹽性較高，拮抗病原菌和促生能力也較強，制備的木霉微生物菌劑在鹽漬土壤作物種植過程中具有較高的應用前景。木霉菌劑目前的應用形式大多是孢子制劑，孢子的產(chǎn)生條件是木霉制劑生產(chǎn)的制約條件，例如深綠木霉可以用于生物防治，但產(chǎn)孢量較少，影響生產(chǎn)應用，池玉杰等[12]對其產(chǎn)孢條件加以研究，得到了深綠木霉最佳產(chǎn)孢條件；又如具有分解纖維素能力的綠色木霉產(chǎn)孢量不能滿足工業(yè)需求，肖龍龍等[13]對其產(chǎn)孢條件加以優(yōu)化，顯著提高了其產(chǎn)孢量。前期研究發(fā)現(xiàn)耐鹽木霉菌株TW320和TW1876培養(yǎng)過程中產(chǎn)孢較少，影響了制劑的制備及應用。本文對TW320和TW1876生長和產(chǎn)孢條件進行探究，尋找最優(yōu)生長和產(chǎn)孢培養(yǎng)基，對木霉制劑工藝的研發(fā)具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

耐鹽木霉菌株深綠木霉(T.atroviride)TW320和擬康寧木霉(T.koningiopsis)TW1876是山東省科學院生態(tài)研究所分別從山東東營黃河三角洲濕地和山東萊蕪雪野湖濕地采集的土樣中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

本研究選擇9種不同培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基、馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基、察氏瓊脂(Czapek dox agar, CDA)培養(yǎng)基、低營養(yǎng)瓊脂(synthetic low nutrient agar, SNA) 培養(yǎng)基、玉米粉葡萄糖瓊脂(cornmal dextrose agar，CMD)培養(yǎng)基、大豆玉米粉(soybean corn flour agar)培養(yǎng)基、無機磷瓊脂 (inorganic phosphorus agar，MPA) 培養(yǎng)基、燕麥瓊脂(oatmeal agar，OA)培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂(malt extract agar，MEA)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分如表1所示。

表1 各培養(yǎng)基成分

1.3 試驗方法

1.3.1 pH對耐鹽木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉將培養(yǎng)基pH調(diào)制成4、5、6、7、8、9、10、11，分別接種直徑5 mm耐鹽木霉菌株TW320和TW1876菌塊于培養(yǎng)基邊緣，在培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)，第3天測量菌落直徑，7 d后測量產(chǎn)孢量。每個處理重復5皿。

產(chǎn)孢量的計數(shù)采用血球計數(shù)板計數(shù)法[14]。取已培養(yǎng)好的菌株，用無菌量筒取無菌水20 mL，分兩次轉移到培養(yǎng)皿中，用5 mL的移液槍將孢子反復吹洗下來，混勻后轉移至已滅菌的50 mL三角瓶中，充分振蕩混勻后，用移液槍吸取少量孢子懸液滴加在血球計數(shù)板蓋玻片的邊緣，用五點法讀取5個小格的孢子數(shù)。

木霉菌孢子個數(shù)(cfu/mL)=[(5小格孢子總數(shù))/5]×25×104×稀釋比例。

1.3.2 不同培養(yǎng)基對耐鹽木霉菌株TW320與TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

將耐鹽木霉菌株TW320和TW1876轉接到PDA培養(yǎng)基，在25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后，用打孔器取直徑5 mm的菌餅，接種到9種不同固體培養(yǎng)基(PDA、Martin、CDA、SNA、CMD、大豆玉米粉、MPA、OA、MEA)的邊緣，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天測量菌落直徑，7 d后用血球計數(shù)法測量產(chǎn)孢量，產(chǎn)孢量計算同上。每個處理重復5皿。

1.3.3 不同碳源、氮源對耐鹽木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

采用察氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，設置7個不同的碳源處理，分別是麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖、甘露醇和淀粉，每1 000 mL添加不同碳源各30 g，制成7種含不同碳源的固體培養(yǎng)基，以不加碳源的培養(yǎng)基作為對照；同時設置9個不同的氮源處理，分別是酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二銨、甘氨酸、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、尿素，每1 000 mL添加不同氮源各3 g，制成9種含不同氮源的固體培養(yǎng)基，以不加氮源的培養(yǎng)基作為對照。

耐鹽木霉菌株TW320和TW1876在PDA培養(yǎng)基中25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后，用打孔器取直徑5 mm的菌塊放至上述各種不同培養(yǎng)基的邊緣，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 3 d后測量菌落直徑，7 d后用血球計數(shù)法測量產(chǎn)孢量，產(chǎn)孢量計算同上。每個處理重復5皿。

1.3.4 不同碳氮比對耐鹽木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究每個處理設5個重復，利用SPSS(版本)軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同pH對耐鹽木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

深綠木霉(T.atroviride)TW320在pH=4～11 內(nèi)均可生長(圖1(a))，pH= 4～8 內(nèi)TW320菌絲較厚，可見綠色孢子產(chǎn)生，pH=9～11菌絲厚度減弱，孢子量減少。統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)：當pH=4,5,6時，生長3 d的菌落直徑無顯著差異，生長速度最快；pH=9時，菌落直徑最?。籶H=5時，TW320菌株生長7 d的產(chǎn)孢量最多，為4.94×107cfu/mL；pH=9時，產(chǎn)孢量最少(表2)。綜上，TW320培養(yǎng)最優(yōu)pH為5。

圖1 pH=4～11范圍內(nèi)木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢情況Fig.1 Mycelium growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 in the pH range 4 to 11

表2 不同pH對木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

擬康寧木霉(T.koningiopsis)TW1876在pH=4～11 范圍內(nèi)菌絲生長濃密(圖1(b))，綠色孢子明顯。統(tǒng)計結果如表2所示，當pH=4、5、6時，菌落直徑不存在顯著差異，此時菌落直徑最大，TW1876生長速度最快；當pH=9時，菌落直徑最小；pH=11時，TW1876菌株生長7 d的產(chǎn)孢量最多，為1.76×108cfu/mL； pH=6時，產(chǎn)孢量最小，為0.47×108cfu/mL。綜上，TW1876培養(yǎng)最優(yōu)pH為11。

2.2 耐鹽木霉菌株TW320和TW1876在不同培養(yǎng)基上的菌絲生長狀況及產(chǎn)孢量

深綠木霉(T.atroviride)TW320在9種培養(yǎng)基上均可生長，但在不同培養(yǎng)基上菌絲量、孢子數(shù)量和孢子顏色有明顯不同(圖2(a))。統(tǒng)計結果顯示：PDA培養(yǎng)基上生長3 d的TW320菌落直徑與其他處理相比存在顯著差異，生長速度最快，在大豆玉米粉培養(yǎng)基上的生長速度次之，在CDA培養(yǎng)基上菌落直徑最??；TW320在大豆玉米粉培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多，為3.13×107cfu/mL，在SNA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最少，為0.05×107cfu/mL(表3)。因此，TW320培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基為大豆玉米粉培養(yǎng)基。

圖2 木霉菌株TW320和TW1876在9種不同培養(yǎng)基上的菌絲生長和產(chǎn)孢狀況Fig.2 Mycelium growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on nine different media

由圖2b可見，擬康寧木霉(T.koningiopsis)TW1876在9種培養(yǎng)基上均可生長,菌絲生長量、產(chǎn)孢量和孢子顏色在不同培養(yǎng)基上表現(xiàn)出明顯差異。在PDA培養(yǎng)基上，TW1876生長最好，菌絲濃密，綠色孢子明顯，其菌落直徑與其他處理存在顯著差異，生長速度最快,在CDA培養(yǎng)基上菌落直徑最??；TW1876在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量也最多，為9.68×107cfu/mL，在大豆玉米粉培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最少，為0.07×107cfu/mL(表3)。綜上，選取PDA培養(yǎng)基為TW1876培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基對木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

2.3 耐鹽木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳源、不同氮源的培養(yǎng)基上的菌絲生長狀況及產(chǎn)孢量

深綠木霉(T.atroviride)TW320可以利用多種碳源生長和產(chǎn)孢(圖3(a))。統(tǒng)計結果顯示：以麥芽糖作為碳源時，培養(yǎng)3 d的TW320的菌落直徑最大，生長速度最快，其次是淀粉、木糖、乳糖、葡萄糖和蔗糖，無碳源的培養(yǎng)基的菌落直徑最??；以木糖作為碳源時產(chǎn)孢量最多，為2.93×106cfu/mL，以淀粉作為碳源時的產(chǎn)孢量最少(表4)。綜上，麥芽糖最有利于TW320菌絲生長，木糖次之，但木糖最有利于其產(chǎn)孢，因此選取木糖作為深綠木霉TW320生長的最佳碳源(表4)。

圖3 木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳源的培養(yǎng)基上的菌絲生長及產(chǎn)孢狀況Fig.3 Mycelial growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on medium containing different carbon sources

擬康寧木霉(T.koningiopsis)TW1876對不同碳源的利用差別顯著(圖3(b))。結果表明：以淀粉和麥芽糖作為碳源時，生長3 d的菌落直徑無顯著差異，生長速度最快，其次是葡萄糖、乳糖和木糖，無碳源時的菌落直徑最??；乳糖作為碳源時，產(chǎn)孢量最多，為6.75×106cfu/mL，無碳源時的產(chǎn)孢量最少。綜上，選取乳糖作為擬康寧木霉TW1876培養(yǎng)基的最佳碳源(表4)。

表4 不同碳源對木霉菌株TW320和 TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

深綠木霉(T.atroviride)TW320在含不同氮源的培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)孢存在明顯差異(圖4(a))。統(tǒng)計結果顯示：以酵母膏為氮源時，TW320菌株菌絲較濃密，其菌落直徑和產(chǎn)孢量與其他處理比均存在顯著差異，生長速度最快，產(chǎn)孢量最多，為5.85×106cfu/mL；在無氮源培養(yǎng)基中TW320生長較慢，產(chǎn)孢量最少，為0.08×106cfu/mL(圖4(a)，表5)。因此，選取酵母膏作為培養(yǎng)深綠木霉TW320的最佳氮源。

圖4 木霉菌株TW320和TW1876在含不同氮源的培養(yǎng)基上的菌絲生長及產(chǎn)孢狀況Fig.4 Mycelial growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on medium containing different nitrogen sources

由圖4(b)可知，擬康寧木霉(T.koningiopsis)TW1876對不同氮源的利用也不同。以酵母膏作為氮源時，其菌落直徑與其他氮源處理相比存在顯著差異，此時TW1876生長速度最快，以蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和牛肉膏為氮源時，菌落生長速度次之，以尿素作為氮源時的菌落生長速度最慢；以甘氨酸為氮源時產(chǎn)孢量最多，為3.83×106cfu/mL，無氮源時的產(chǎn)孢量最少，為0.3×106cfu/mL(表5)。綜上，以甘氨酸為氮源時，TW1876生長速度較快，產(chǎn)孢量最多，故以甘氨酸作為培養(yǎng)TW1876的最佳氮源(表5)。

表5 不同氮源對TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

2.4 耐鹽木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳氮比的培養(yǎng)基上的菌絲生長狀況及產(chǎn)孢量

圖5 木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳氮比的培養(yǎng)基上的菌絲生長及產(chǎn)孢狀況Fig.5 Mycelial growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on medium with different C/N ratios

表6 不同碳氮比對木霉菌株TW320和TW1876菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

3 討論

目前我國土壤鹽漬化面積連年增加，嚴重影響了植物的生長，降低了糧食的產(chǎn)量。植物-微生物聯(lián)合修復方法的出現(xiàn)可以有效緩解這種狀況。Siemering 等[15]在研究報告中指出，植物根系環(huán)境是真菌的主要棲息地。木霉作為一種植物促生真菌，可以定殖在植物根部，不僅可以促進植物生長，還可以提高植物的抗逆能力，從而減少化肥、農(nóng)藥的使用，避免給環(huán)境造成污染，促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。耐鹽木霉的使用可以提高植物對鹽漬環(huán)境的適應能力,是減輕土壤鹽漬化危害以及開發(fā)利用沿海灘涂等鹽漬化土地資源的重要途徑之一。但是，耐鹽木霉的產(chǎn)孢量不足，限制了大規(guī)模生產(chǎn)孢子制劑。

耐鹽木霉固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化實驗，為大量獲取孢子提供了可能，為木霉制劑的發(fā)展做好了準備工作，對未來農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的社會和生態(tài)學意義。