劉雙，董紅敬*，張艷艷，王曉，劉紋紋

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) a. 山東省分析測試中心；b.藥學院，山東 濟南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

便秘是指由于大腸傳導功能異常引起的一種腸道疾病，主要表現(xiàn)為排便次數減少、排便困難、糞便干硬等，嚴重影響生活質量[1-3]。當前，治療便秘的藥物還是以化學藥物為主，比如溶劑性瀉藥，然而，化學藥物在治療便秘的同時會伴隨著一定程度的副作用，并且停藥后存在病情復發(fā)的情況[4-6]。中醫(yī)在便秘的治療方面具有豐富的臨床經驗，注重辨證施治，中藥復方紛繁多變[7]。早在《傷寒雜病論》中記載胃熱過盛、脾陰不足可導致便秘，提出了“脾約”“陽結”“陰結”等病名[1]。

網絡藥理學是闡明藥物-成分-靶點-疾病之間的內在聯(lián)系，揭示藥物的作用途徑、藥物與疾病之間的關聯(lián)性的一門前沿學科[8]，基于系統(tǒng)生物學和多向藥理學研究理論、高通量篩選和網絡分析及可視化技術等[9]，系統(tǒng)地、整體地分析中藥復方，有利于從分子機制方面闡明成分在預防或治療疾病方面發(fā)揮作用的途徑，揭示中藥多成分-多靶點-多途徑的效用特點[10]；分子對接是在網絡藥理學挖掘出化學成分和靶點的基礎上，運用計算機軟件模擬藥物分子與大分子靶標的結合區(qū)域，通過計算物理和化學鍵值來預測結合能及結合方式的技術[11]，對于揭示藥物分子與靶點在體內的結合情況具有一定程度的輔助作用。

近年來，中醫(yī)藥治療便秘的數據挖掘研究集中于用藥規(guī)律分析，而挖掘出眾多復方中的核心中藥并闡明其作用機制的研究較少。本文采用數據挖掘和網絡藥理學方法，探究治療便秘的中藥復方的用藥規(guī)律，并闡明核心中藥的作用機制，借助分子對接進一步進行核心成分和核心靶點的結合驗證，為治療便秘新復方的開發(fā)提供依據，也為傳統(tǒng)中藥科學性的現(xiàn)代闡釋提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據來源

通過中國知網(https://www.cnki.net/)數據庫、維普中文期刊服務平臺(http://qikan.cqvip.com/)及萬方數據知識服務平臺(https://www.wanfangdata.com.cn/index.html)，以“便秘”為關鍵詞，檢索相關文獻，查找治療便秘的中藥處方，檢索時間為建庫至2021年9月28日。

1.2 數據篩選及規(guī)范化處理

數據錄入由兩位研究員獨立完成并交叉核對，當出現(xiàn)分歧時通過討論決定，確保錄入信息準確無誤。

納入標準：①文獻中復方數據來源于治療便秘的臨床實驗研究；②給藥方式為口服；③處方明確的中藥復方；④療效明確且顯著。

排除標準：①綜述類及動物實驗類文獻；②中藥復方組成不全的文獻。

數據規(guī)范：根據《中國藥典》2020版[12]以及《中華本草》[13]來規(guī)范各處方的中藥名稱，如熟地規(guī)范為熟地黃，首烏規(guī)范為何首烏，浙貝規(guī)范為貝母。

1.3 用藥規(guī)律分析

將篩選并規(guī)范好的中藥復方錄入Excel表格中，使用數據透視表統(tǒng)計藥物的使用頻率，采用SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 26.0軟件進行復雜網絡、關聯(lián)規(guī)則以及聚類分析，并利用Cytoscape軟件進行網絡可視化分析。

1.4 網絡藥理學分析

綜合分析用藥頻次、復雜網絡、關聯(lián)規(guī)則以及聚類分析結果，篩選出核心藥物。通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP)獲取核心藥物的化學成分及靶點，采用STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)查詢靶點蛋白對應的基因名稱；基于GeneCards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)等數據庫，以“constipation”為關鍵詞查詢并收集疾病靶點，采用Venny平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取藥物靶點與疾病靶點的共有靶點，作為治療便秘的潛在靶點；利用Excel使?jié)撛诎悬c與化學成分相互映射，利用Cytoscape軟件構建藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網絡并分析拓撲網絡，根據度值(degree)得到關鍵靶點；采用STRING數據庫獲取關鍵靶點的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，基于DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對關鍵靶點進行基因本體(Gene ontology， GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)通路富集分析。

2 結果

2.1 復方數據統(tǒng)計及用藥頻次分析

共獲得中藥治療便秘的復方85個，涉及141味中藥。通過分析，發(fā)現(xiàn)使用頻率≥10的藥物有25味(詳見OSID科學數據與內容)，累計頻次455次，占總頻次的66.52%，屬于高頻藥物。其中，出現(xiàn)頻次前10的中藥依次為白術、當歸、枳實、火麻仁、地黃、肉蓯蓉、黃芪、厚樸、杏仁和枳殼。

2.2 關聯(lián)規(guī)則分析

對數據進行整理，將含有這味藥物標記為Y，不含這味藥物標記為N。運用SPSS Modeler 18.0軟件進行關聯(lián)規(guī)則分析，通過源節(jié)點導入Excel格式數據，數據類型設置為標記，角色設置為任意，將數據節(jié)點與數據類型節(jié)點進行連接，僅顯示true值標志，顯示的最大鏈接數設置為40，設置“弱鏈接上限”為5，“強鏈接下限”為15，按照鏈接大小連續(xù)變化進行繪圖，分析藥物關聯(lián)規(guī)則(圖1)；其中，連線的粗細表示兩種藥物在同一復方中出現(xiàn)的頻率。圖中顯示，白術、當歸、枳實、火麻仁的相關性較強，在治療便秘的中藥復方中一起使用頻次較高。在建模選項板下，選擇關聯(lián)中的Apriori算法，將Apriori 節(jié)點與類型節(jié)點相連接，使用預定義角色，選擇最低條件支持度10%，最小規(guī)則置信度80%，最大前項數為2，對藥物進行關聯(lián)規(guī)則分析。根據Apriori 算法，一共產生1 464 條規(guī)則，主要的關聯(lián)規(guī)則見表1、表2。

圖1 治療便秘的中藥復方藥物關聯(lián)規(guī)則Fig.1 Association rules of traditional Chinese medicine for treating constipation

表1 常用2味藥物組合關聯(lián)規(guī)則

表2 常用3味藥物組合關聯(lián)規(guī)則

2.3 聚類分析

結合高頻藥物使用統(tǒng)計表，選取頻次≥10的藥物，采用SPSS Statistics 20.0 軟件平均聯(lián)接(組間)、皮爾遜相關系數的方法進行系統(tǒng)聚類分析，生成樹狀聚類圖(見OSID科學數據與內容)。自聚類分析譜系圖上的聚類距離選擇為20，可將藥物分為5類。Ⅰ類：地黃、玄參、麥冬、火麻仁、郁李仁；Ⅱ類：黃芪、黨參、陳皮、白術、炙甘草、當歸、肉蓯蓉、何首烏、杏仁；Ⅲ類：甘草、柴胡、白芍、枳殼、牛膝、厚樸、桃仁；Ⅳ類：檳榔、木香、枳實；Ⅴ類：大黃。

2.4 網絡藥理學分析

綜合分析數據挖掘結果，白術、當歸、枳實、火麻仁的使用頻率最高，為進一步探究4味藥物的具體作用機制，采用網絡藥理學和分子對接技術進行深層次分析。

基于TCMSP數據庫，建立4味藥物的化學成分及靶點庫，數據庫獲取核心藥物的化學成分及靶點，共得到370個藥物靶點；采用GeneCards、TTD、TCMIP、OMIM、DrugBank等數據庫獲取疾病靶點，整合去重，共得到便秘相關靶點5 533個；采用Venny平臺相互映射藥物靶點與疾病靶點后共得到246個潛在靶點(圖2)。

圖2 Venn圖Fig.2 Venn diagram

潛在靶點與化學成分相互映射分析，共得到白術中化學成分48個、當歸中化學成分67個、枳實中化學成分50個、火麻仁中化學成分37個；采用Cytoscape軟件構建藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網絡(見OSID科學數據與內容)，網絡共包含439個節(jié)點、2 025條網線；運用Network Analysis工具分析拓撲網絡并篩選出度值≥5的關鍵靶點90個。

借助STRING數據庫建立關鍵靶點的PPI網絡并利用Cytoscape實現(xiàn)網絡可視化(圖3)，分析拓撲網絡，節(jié)點的大小和顏色的深淺表示其度值的高低，節(jié)點越大表示度值越高，顏色由黃色漸變成橙色表示度值逐漸提高，度值排名前10的靶點見表3，篩選度值最高的AKT1(度值≥57)作為核心靶點。

表3 度值排名前10的靶點(度值≥41)

圖3 PPI網絡Fig.3 PPI network

基于DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO富集分析(圖4)和KEGG通路富集分析(圖5)。GO富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能三個部分。其中，關鍵靶點富集的生物過程條目有對藥物的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控等；細胞組分條目有細胞核、胞質溶膠、細胞質等；分子功能條目有蛋白質結合、相同的蛋白質結合、蛋白質同源二聚化活性等。

圖4 Go富集分析Fig.4 Go enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

選擇藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網絡中每種藥物度值最高的化學成分作為核心成分，通過Pubchem數據庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)下載核心成分的sdf格式文件，并借助OpenBabel軟件轉換成mol2格式；通過RCSB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點AKT1的結構式，并借助Pymol軟件進行去水、去小配體操作。運用AutoDock進行分子對接；在分子對接中，結合能為負數，說明化學成分和靶點蛋白之間結合會放出能量，可以自發(fā)地穩(wěn)定結合。4個化學成分芹菜素、甘氨酸、β-豆甾醇、植物甾醇與核心靶點AKT1的結合能均為負值(表4)?；瘜W成分之間均可通過氫鍵產生相互作用，結合后的構象穩(wěn)定(圖6)。

表4 核心化學成分與核心靶點AKT1的結合能

圖6 分子對接結果Fig.6 Molecular docking results

3 討論

Apriori算法是一種挖掘關聯(lián)規(guī)則的頻繁項集算法，支持度和置信度可以表示關聯(lián)規(guī)則的強度[14]。關聯(lián)規(guī)則結果顯示，白術-黃芪，白術-黃芪-當歸分別是同一個組里支持度最高的組合。有研究表明，白術丙酮提取物經灌胃給藥，可抑制大鼠胃排空，能夠促進小腸的輸送功能[15]。通過研究白術揮發(fā)油影響正常小鼠及用阿托品處理后小鼠的腸推進及胃排空實驗，發(fā)現(xiàn)白術揮發(fā)油能促進胃腸運動，進而實現(xiàn)促消化作用[16]。黃芪能增加部分消化道長度、降低吸收部位的空腸單位質量，有利于物質吸收[17]。黃芪多糖可通過改善消化系統(tǒng)的形態(tài)結構，進而提高機體的消化能力，加強小腸對營養(yǎng)物質的吸收作用，促進動物的生長發(fā)育完全[18]。當歸揮發(fā)油具有解痙、抗炎、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用，特別是對平滑肌有明顯的藥理活性[19]。當歸揮發(fā)油能抑制正常小鼠的胃排空, 也能明顯解除乙酰膽堿誘發(fā)的小鼠胃腸平滑肌痙攣, 減慢胃排空和腸推進[7]。

聚類分析能在多維空間或模式空間發(fā)現(xiàn)隱藏的結構，利用確定的標準計算出所有樣品之間的相關性，根據相關程度將其簡化合并，從而可以直觀地進行相似品種及組分信息的綜合比較[20]，對頻次≥10的藥物進行聚類分析。聚類Ⅰ為養(yǎng)陰潤腸方中的藥物，地黃、玄參、麥冬三者合用，養(yǎng)陰生津，專治溫病津傷，腸燥便秘；火麻仁、郁李仁均為潤腸通便之良藥[21]。聚類Ⅱ為益氣健脾通便方，方中白術為君，重在調運脾氣，杏仁，斂降肺氣，助胃腸氣降，同時佐以當歸、肉蓯蓉溫陽補血、潤腸通便，陳皮理氣化滯，共為佐藥; 炙甘草協(xié)君藥健脾，助臣藥補氣，共佐藥滋潤，調和諸藥，諸藥合用，共奏益氣健脾、潤腸通便之功。黃芪益氣升清，黨參健脾養(yǎng)陰，共為臣藥，助君藥健脾[22]。聚類Ⅲ為甘草、柴胡、白芍、枳殼、牛膝、厚樸、桃仁，其中，甘草、柴胡、白芍、枳殼、厚樸能疏肝健脾、行氣止痛，桃仁可潤腸通便，牛膝具有逐瘀通經，引血下行之功效。聚類Ⅳ為疏肝理脾潤腸湯中的藥物，枳實具有破氣消積之功效，木香能行氣止痛、健脾消食，檳榔可積行氣。聚類Ⅴ為大黃，利濕退黃，瀉熱通便[23]。

網絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，4種核心藥物主要是通過調節(jié)癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、p53信號通路等信號通路，達到治療便秘的目的。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路調節(jié)細胞的存活、生長、分化、細胞代謝和細胞骨架的重組等[24]，研究表明，該信號通路是胰島素調控血糖平衡的重要通路，通路中主要因子的穩(wěn)定表達能夠保證標準的 PI3K/Akt 途徑傳導，是實現(xiàn)骨骼肌細胞對葡萄糖攝取、維持糖代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵[25]。歐宏宇等[26]發(fā)現(xiàn)胃癌細胞AGS細胞的凋亡與p53信號通路的激活有關，通過上調p53 mRNA和蛋白表達水平并促進p53蛋白核轉位，同時促進凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、PUMA和Bax表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，進而誘導細胞調亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。通過PPI網絡篩選出核心靶點AKT1，AKT1是PI3K/Akt信號通路下游的靶點，與炎癥反應的調節(jié)密切相關，而促炎因子IL-6的過度表達會引起腸道炎，進而影響胃腸道運動及分泌功能的正常運行，其作用機制可能是激活胃腸道黏膜下層的神經元進而影響胃腸蠕動。分子對接結果顯示，4種藥物的核心成分均能與核心靶點AKT1進行自發(fā)地結合，釋放出能量，主要的結合方式為氫鍵，其中，AKT1與植物甾醇的結合能最低，為-19.72 kJ/mol，表明其結合后的親和作用較強和構象穩(wěn)定。此外，芹菜素與AKT1的殘基TYR299之間以氫鍵相連；甘氨酸通過氫鍵與AKT1的殘基LEU155發(fā)生相互作用；植物甾醇與AKT1的殘基TYR299之間以氫鍵相連；β-谷甾醇通過氫鍵與AKT1的殘基TYR299發(fā)生相互作用。

綜上所述，中藥復方治療便秘以健脾益氣、潤腸通便為主，白術、當歸、枳實、火麻仁是使用頻次較高的核心藥物。同時，采用網絡藥理學及分子對接技術分析了4種核心中藥的分子作用機制，表明核心中藥中化學成分所作用的關鍵靶點，主要參與癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、p53信號通路等信號通路，發(fā)揮治療便秘的作用，該研究為治療便秘的中藥復方的研發(fā)提供了思路，為臨床應用提供了理論基礎。