高潔，宋祥云，馬天宇，劉峰，ROMAN Kachan，王曉*

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東科學(xué)院) 基輔學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；3.基輔國(guó)立工藝設(shè)計(jì)大學(xué)，烏克蘭 基輔 01011)

蒲公英為菊科多年生草本植物，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效[1]。作為一種藥食同源的植物，蒲公英在我國(guó)種植廣泛，資源豐富。蒲公英的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括多酚類、萜類、植物甾醇類、倍半萜內(nèi)酯類和香豆素類等[2]。研究表明，蒲公英多酚類物質(zhì)具有抗氧化[3]、抗癌[4]、抑菌[5]、抗炎[6]、降血糖[7]等方面的藥理活性。

為進(jìn)一步深入研究蒲公英多酚化合物的藥理活性，需要分離制備出更多的單體化合物。蒲公英多酚類物質(zhì)成分復(fù)雜，且分離制備難度大，目前常用的分離制備方法以柱色譜為主[8]，其樣品制備效率低、耗時(shí)長(zhǎng)。而逆流色譜具有制備量大、分離效果好、操作方便等特點(diǎn)，其獨(dú)特的液液分配原理，避免了固體載體對(duì)成分的不可逆吸附和降解作用，已被廣泛應(yīng)用于多酚類[9]、生物堿類[10]、三萜類[11]和多肽類[12]等天然產(chǎn)物的制備分離。現(xiàn)階段采用逆流色譜對(duì)蒲公英多酚進(jìn)行分離的研究報(bào)道相對(duì)較少[13]。本文以蒲公英藥材為原材料，采用pH區(qū)帶逆流色譜(pH-zone-refining counter-current chromatography，pH-ZRCCC)結(jié)合高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography ，HSCCC)對(duì)蒲公英多酚進(jìn)行分離純化，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為蒲公英藥理活性和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要原料

蒲公英購(gòu)于山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司中藥飲片廠，經(jīng)齊魯工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院劉偉教授鑒定為菊科植物蒲公英的干燥全草；實(shí)驗(yàn)用正丁醇、正己烷、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、氨水、三氟乙酸等試劑均為分析純，購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；用于HPLC分析的甲醇為色譜純，購(gòu)于美國(guó)天地公司。

1.2 儀器設(shè)備

TBE-300C高速逆流色譜儀、TBP-5002輸液泵、DC-0506低溫恒溫槽(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)，8823B紫外檢測(cè)器(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司)，3057-11便攜式記錄儀(重慶川儀自動(dòng)化股份有限公司)，UB-7 pH計(jì)(丹佛儀器有限公司)，BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)，Agilent 1120型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，布魯克ADVANCE DPX 400核磁共振波譜儀、布魯克AVIII HD 600核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蒲公英多酚的提取

2.2 目標(biāo)化合物在兩相溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的測(cè)定

2.2.1 pH-ZRCCC分配系數(shù)的測(cè)定

稱取約5 mg樣品置于10 mL試管中。配置好溶劑系統(tǒng)，取上下相各5 mL置于裝有樣品的試管中，滴加氨水至pH為10左右，震蕩試管至樣品完全溶解，靜置分層。取上下相各10 μL，分別用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。用上相的峰面積(AU)比下相的峰面積(AL)計(jì)算堿性條件下樣品的分配系數(shù)Kbase，計(jì)算公式如下：Kbase=AU/AL。再向該試管中滴加三氟乙酸至pH約為2，震蕩搖勻，靜置分層，按同樣的方法各取10 μL上下相，利用HPLC計(jì)算分配系數(shù)Kacid。

2.2.2 HSCCC分配系數(shù)的測(cè)定

稱取約5 mg樣品于10 mL試管中。配置好溶劑系統(tǒng)，取上下相各5 mL于裝有樣品的試管中，劇烈震蕩至樣品完全溶解，靜置分層，分別取上下相各10 μL利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，上相的峰面積(A1)比下相的峰面積(A2)即為分配系數(shù)K，計(jì)算公式如下：K=A1/A2。

2.3 兩相溶劑系統(tǒng)的制備

2.3.1 pH-ZRCCC溶劑體系的配制

稱取樣品，取等量酸化的上相與不加堿的下相溶解樣品，用于后續(xù)逆流色譜分離。

2.3.2 HSCCC溶劑體系的配制

稱取樣品，取等量的上下相將樣品溶解備用。

2.4 逆流色譜分離

2.4.1 pH-ZRCCC分離

以30 mL/min將上相泵入高速逆流色譜儀作為固定相，待固定相充滿色譜螺旋管后，將樣品溶液注入分離柱內(nèi)。開啟速度控制器，使分離柱按順時(shí)針方向以800 r/min的速度旋轉(zhuǎn)，同時(shí)以2 mL/min的速度泵入下相溶液。開啟紫外檢測(cè)器，將波長(zhǎng)調(diào)為280 nm，根據(jù)色譜圖收集色譜峰組分，并使用pH計(jì)檢測(cè)餾分的酸堿度。分離結(jié)束后，使用壓力泵將柱內(nèi)剩余液體吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的體積比尾吹總體積來計(jì)算固定相的保留率。

2.4.2 HSCCC分離

以30 mL/min速度泵入上相作為固定相，待固定相充滿色譜螺旋管后，開啟速度控制器，使分離柱按順時(shí)針方向以800 r/min的速度旋轉(zhuǎn)，同時(shí)以2 mL/min的速度泵入下相。當(dāng)體系達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡后，將樣品注入分離柱內(nèi)。開啟紫外檢測(cè)器，在波長(zhǎng)280 nm下根據(jù)色譜圖收集色譜峰組分。分離結(jié)束后，使用壓力泵將柱內(nèi)剩余液體吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的體積比尾吹總體積來計(jì)算固定相的保留率。

將分離出的各部分組分減壓濃縮至干燥，密封保存于冰箱內(nèi)。

2.5 HPLC分析和結(jié)構(gòu)鑒定

將蒲公英總樣以及分離純化所得的組分使用HPLC進(jìn)行分析。HPLC的分析條件按表1進(jìn)行，色譜柱為Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL。并采用歸一化的方法計(jì)算樣品純度。將分離純化的各組分用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization ion trap mass spectrometry, ESI-MS)和核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)分析，鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

表1 蒲公英HPLC梯度洗脫條件

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC分析結(jié)果

圖1為蒲公英多酚粗提物和制備的純品的HPLC分析圖。在280 nm下使用峰面積歸一化法計(jì)算，目標(biāo)化合物I～VI在總樣中的峰面積比分別為，40.01%(化合物I)，9.07%(化合物II)，6.68%(化合物III)，1.34%(化合物IV)，4.50%(化合物V)，8.37%(化合物VI)。

圖1 蒲公英多酚粗提物和純組分的HPLC分析圖Fig.1 HPLC analysis of crude extract and pure components of Herba Taraxaci polyphenols

3.2 pH-ZRCCC的分離

pH-ZRCCC制備量大，適用于濃度大于0.1 mmol，最好高于1 mmol的組分[14]。因此首先選用pH-ZRCCC法對(duì)蒲公英中含量較高的多酚組分進(jìn)行分離，同時(shí)將微量組分富集。

表2 目標(biāo)化合物I～Ⅵ在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)Kacid和Kbase

圖2 蒲公英粗提物的pH-ZRCCC分離圖Fig.2 pH-ZRCCC separation diagram of crude extract of Herba Taraxaci

3.3 HSCCC的分離

混合物A經(jīng)pH-ZRCCC法分離后未能達(dá)到分離的效果，推測(cè)其酸堿性可能相近或組分含量較少，適合應(yīng)用HSCCC法對(duì)其再次進(jìn)行分離。

圖3 蒲公英回收組分HSCCC分離圖Fig.3 HSCCC separation diagram of recovered components of Herba Taraxaci

3.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物I：ESI-MS，m/z:179.0332[M-H]-。1H-NMR(400 MHz,DMSO)δ:8.43(s,1H),7.33(d,J=15.8 Hz,1H), 7.02 (s, 1H), 6.90 (d,J=8.1 Hz, 1H), 6.75 (d,J=8.1 Hz, 1H), 6.18 (d,J=15.8 Hz, 2H)。13C-NMR(100 MHz, DMSO) δ 169.35 (s), 148.64 (s), 146.30 (s), 143.50 (s), 126.40 (s), 121.16 (s), 117.61 (s), 116.38 (s), 115.06 (s)。與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的咖啡酸數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物Ⅰ為咖啡酸。

化合物II：ESI-MS，m/z:163.0288[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ:7.49 (t,J=11.7 Hz, 3H), 6.79 (d,J=8.5 Hz, 2H), 6.29 (d,J=15.9 Hz, 1H), 1.23 (s, 1H)。13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 159.88 (s), 144.27 (s), 130.48 (s), 116.20 (s)。與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的對(duì)羥基肉桂酸數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物Ⅱ?yàn)閷?duì)羥基肉桂酸。

化合物III：ESI-MS，m/z:253.0653[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.49 (d,J=15.9 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 7.00 (d,J=8.2 Hz, 1H), 6.77 (d,J=8.1 Hz, 1H), 6.26 (d,J=15.9 Hz, 1H), 4.15 (dd,J=11.2, 4.0 Hz, 1H), 4.00 (dd,J=11.1, 6.5 Hz, 1H), 3.75-3.66 (m, 1H), 1.24 (s, 2H)。13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 167.09 (s), 148.92 (s), 146.08 (s), 145.55 (s), 125.96 (s), 121.80 (s), 116.24 (s), 115.23 (s), 114.46 (s), 69.90 (s), 66.08 (s), 63.17 (s)。與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的1-O-咖啡?；视蛿?shù)據(jù)一致，故鑒定化合物Ⅲ為1-O-咖啡?；视汀?/p>

化合物IV：ESI-MS，m/z:167.0277[M-H]-。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 8.84 (s, 1H), 6.64 (d,J=2.6 Hz, 2H), 6.63 (s, 1H), 6.48 (dd,J=8.0, 2.1 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H)。13C NMR (150 MHz, DMSO) δ 173.77 (s), 145.43 (s), 144.43 (s), 126.32 (s), 120.46 (s), 117.13 (s), 115.79 (s)。與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的3,4-二羥基苯乙酸數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物Ⅳ為3,4-二羥基苯乙酸。

化合物V：ESI-MS，m/z:153.0089[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.31-7.25 (m, 1H), 6.78 (d,J=8.2 Hz, 1H)。13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 167.77 (s), 150.45 (s), 145.34 (s), 122.34 (s), 122.14 (s), 117.01 (s), 115.60 (s)。與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的原兒茶酸數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物Ⅴ為原兒茶酸。

化合物VI：ESI-MS，m/z:151.0288[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.15 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 7.03 (d,J=8.3 Hz, 1H), 6.69 (d,J=8.3 Hz, 1H)。13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 173.59 (s), 156.50 (s), 130.71 (s), 125.60 (s), 115.48 (s)。與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的對(duì)羥基苯乙酸數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物Ⅵ為對(duì)羥基苯乙酸。

4 結(jié)論

本研究利用pH-ZRCCC和HSCCC相結(jié)合的方法對(duì)蒲公英多酚進(jìn)行分離，成功地分離出了6個(gè)多酚類化合物。在實(shí)驗(yàn)過程中首先利用pH-ZRCCC將蒲公英中含量高的多酚類成分分離出來并對(duì)低含量成分進(jìn)行富集，再利用HSCCC實(shí)現(xiàn)其他低含量多酚成分的分離，有效地縮短了分離制備的時(shí)間。本方法操作簡(jiǎn)單，快速高效，為分離多酚類化合物提供了新的高效制備方法，同時(shí)也為蒲公英的開發(fā)利用提供了技術(shù)支撐，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。