梁瑩，吳西雅，肖祖克

江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330000

肺癌系呼吸道惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均處于第1位，現(xiàn)已成為全球主要健康問題[1]。據(jù)相關(guān)研究報道顯示，肺癌每年新發(fā)病例超210萬，且死亡人數(shù)超180萬[2]，而1/3新發(fā)病例和2/5死亡病例均來自中國，且近幾年來發(fā)病率有上升趨勢[3]。目前，肺癌治療以放化療手段為主，雖可較好改善患者生存質(zhì)量，但5年生存期仍較低。隨著基因組時代及分子生物學(xué)的發(fā)展，表觀遺傳學(xué)已成為癌癥研究的新熱點，其調(diào)控機(jī)制包括DNA甲基化、非編碼RNA表達(dá)及組蛋白修飾等，其中DNA甲基化與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)[4]。經(jīng)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫篩選肺癌基因發(fā)現(xiàn)，組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)啟動子區(qū)異常甲基化可導(dǎo)致TFPI-2表達(dá)下降，促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[5-6]。而啟動子異常甲基化于腫瘤早期或癌前便已出現(xiàn)，可較好預(yù)測腫瘤發(fā)生，具有較高特異性，基于此機(jī)制研發(fā)的靶向藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市且推薦用于骨髓異常增生類疾病治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR在結(jié)腸癌[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、胰腺癌[9]及肺癌[10]等實體瘤治療中亦可發(fā)揮作用，但同樣也發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR具有不良反應(yīng)，可引起嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)及骨髓抑制等。研究表明，從莪術(shù)、姜黃等中草藥中提取出來的姜黃素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移及抗炎等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，且可調(diào)控DNA甲基化，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明[11-13]?；诖?，本文以TFPI-2及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b等為切入點探討姜黃素對TFPI-2基因甲基化的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞人肺腺癌A549細(xì)胞株，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，貨號：ZQ0003。

1.2 藥物與試劑姜黃素(美國Sigma公司，批號：C1386-10G)；DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo fisher scientific公司，貨號：11966025)；MagicPure?Cell-Free DNA Kit II(含Magnetic Stand) DNA提取試劑盒、MagicPure?Simple Viral DNA/RNA Kit(含Magnetic Stand)RNA提取試劑盒、PerfectStart?Taq DNA Polymerase(含2.5 mM dNTPs)擴(kuò)增試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：EC211、EC311、AP401)；引物合成委托美國Invitrogen公司完成。

1.3 儀器Applied Biosystems Veriti型PCR儀(美國Thermo fisher scientific公司)；Ts2型倒置相差顯微鏡(日本NIKON公司)；MDF-382E(N)型-86 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)；3-18KS型低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司，離心半徑：16 cm)；Gel Dox XR型凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；SW-CJ-2F型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)將含細(xì)胞的凍存管投入37 ℃水溫箱中迅速解凍，自主晃動待其完全融化后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，混勻后1 000 r·min-1離心5 min，棄上清后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待80%～90%細(xì)胞貼壁生長時，棄除舊培養(yǎng)液，采用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，并用0.25%胰酶消化后進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮、圓潤時添加 2 mL 培養(yǎng)基。將貼壁細(xì)胞作離心處理后，將1個培養(yǎng)瓶中的白色沉淀細(xì)胞均勻接種至3個新的培養(yǎng)瓶中并放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取長勢良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分別設(shè)置為姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組及空白對照組?？瞻讓φ战M細(xì)胞采用30 mL完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，姜黃素各劑量組分別采用30 mL含20 μmol·L-1、40 μmol·L-1及80 μmol·L-1的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后棄除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，收集處理后的A549細(xì)胞以待進(jìn)一步實驗。

2.2 MTT法檢測A549細(xì)胞的增殖情況將2.1項下處理后的A549細(xì)胞依次加入96孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為4×104mL，每孔接種200 μL，設(shè)置3個復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL MTT試劑，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)培養(yǎng)15 min，使用振蕩器震蕩10 min使其充分混勻，采用酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處光密度(optical density，OD)值，計算細(xì)胞抑制率。實驗重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

細(xì)胞抑制率=(OD空白對照組-OD處理組)/OD空白對照組×100%

2.3 RT-PCR檢測TFPI-2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表達(dá)水平使用RNA提取試劑盒將2.1項下處理后的A549細(xì)胞總RNA提取出來，以1 μg RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采取相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性5 min后，每周期：95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共計循環(huán)40周期。對特異性曲線進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參基因的OD值分析TFPI-2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA相對表達(dá)情況，以2-△△Ct表示，實驗重復(fù)進(jìn)行3次，取均值。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.4 甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)法檢測TFPI-2基因甲基化狀態(tài)使用DNA提取試劑盒提取2.1項下處理后的A549細(xì)胞中的DNA，以2 μg DNA為模板，使用重亞硫酸鹽處理，按說明書規(guī)范操作進(jìn)行DNA純化，而后進(jìn)行甲基化特異性擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PCR buffer 2.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，Taq酶0.1 μL，DNA模板2 μL，三蒸水 13.9 μL，共20 μL。反應(yīng)循環(huán)條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共計35個循環(huán)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，采用溴化乙錠染色，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。以人類胎盤組織DNA經(jīng)甲基化酶SssI轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物作為甲基化的陽性對照，健康人淋巴細(xì)胞DNA作為陰性對照，雙蒸水作為空白對照。引物序列見表2。

表2 MSP引物序列

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對A549細(xì)胞增殖情況的影響隨姜黃素濃度升高、干預(yù)時間延長，A549細(xì)胞OD值呈下降趨勢，于濃度40 μmol·L-1且處理細(xì)胞48 h時OD值為最低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞抑制率結(jié)果顯示：各劑量姜黃素處理細(xì)胞12 h、24 h及48 h后均可抑制細(xì)胞增殖。見表3、圖1。

表3 姜黃素對A549細(xì)胞增殖情況的影響

圖1 各組A549細(xì)胞抑制率變化

3.2 姜黃素對TFPI-2mRNA、DNMT1mRNA、DNMT3amRNA、DNMT3bmRNA相對表達(dá)情況的影響與空白對照組比較，姜黃素各劑量組TFPI-2mRNA相對表達(dá)水平升高，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA相對表達(dá)水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 姜黃素對TFPI-2 mRNA、DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA相對表達(dá)情況的影響

3.3 姜黃素對TFPI-2甲基化的影響空白對照組未顯示甲基化及去甲基化產(chǎn)物，陰性對照組僅顯示去甲基化產(chǎn)物，陽性對照組僅顯示甲基化產(chǎn)物，姜黃素各劑量組除顯示甲基化產(chǎn)物外，亦可見去甲基化產(chǎn)物，尤以姜黃素中劑量組去甲基化產(chǎn)物條帶最為明顯。見圖2。

注：m：甲基化產(chǎn)物；u：去甲基化產(chǎn)物；0：空白對照組；1：陰性對照組；2：陽性對照組；3：姜黃素低劑量組；4：姜黃素中劑量組；5：姜黃素高劑量組

4 討論

TFPI-2已被證實為一類抑癌基因，可通過以下機(jī)制抑制腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[14]：①TFPI-2通過抑制MMPs在內(nèi)的蛋白酶活性阻斷ECM重塑，進(jìn)而維持ECM結(jié)構(gòu)完整性；②上調(diào)Fas-α、TNF-α表達(dá)使Caspase-3、Caspase-9凋亡通路活性增強，進(jìn)而誘使細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效果；③拮抗組織因子阻斷血管生成。當(dāng)肺癌發(fā)生后，TFPI-2基因啟動子區(qū)的CpG島(鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū))甲基化使TFPI-2基因表達(dá)下降或者缺失，進(jìn)而引起腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移。姜黃素是從中藥姜黃、莪術(shù)等中藥中提取出來的一類酸性多酚類物質(zhì)，具有廣泛藥理作用，譬如抗凝、降脂、抗炎、抗腫瘤等，且有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過抑制DNMT1甲基轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致多種基因低甲基化[15]。He等[16]研究證實，姜黃素可抑制非小細(xì)胞肺癌中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。此外，研究表明，5-Aza-CdR可通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合使其活性受到抑制，進(jìn)而使TFPI-2基因異常甲基化得以逆轉(zhuǎn)[17]?；诖耍狙芯刻接懡S素是否可通過抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶活性來抑制TFPI-2基因甲基化，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度姜黃素處理后，A549細(xì)胞OD值均有所下降，可見姜黃素可對A549細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，且與濃度、時間有一定依賴性，其中濃度40 μmol·L-1的姜黃素處理細(xì)胞48 h時抑制率最高，可見姜黃素對A549細(xì)胞的增殖抑制作用與濃度不呈線性依賴，這與陳馨等[18]認(rèn)為姜黃素濃度在40～60 μmol·L-1時可發(fā)揮良好去甲基化效應(yīng)有一定類似。

DNA甲基化主要由DNMT催化，目前已知的DNMT包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，其中DNMT1可參與新合成單鏈DNA甲基化，并將甲基化信息傳遞給子代細(xì)胞，DNMT3a、DNMT3b則負(fù)責(zé)胚胎時期的DNA甲基化。已有研究證實，DNMT在細(xì)胞周期G0/G1期表達(dá)異常，可沉默抑癌基因，使阻斷信號消除，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。因此，尋找一種可抑制DNMT活性的藥物逆轉(zhuǎn)抑癌基因沉默，可能為治療肺癌的新興靶點。而姜黃素已被證實可激活NRF2、WIF-1、PTEN等抑癌基因啟動子區(qū)DNA去甲基化過程[19]。現(xiàn)深入探討姜黃素對影響肺癌TFPI-2基因甲基化的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的作用，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同劑量姜黃素組TFPI-2mRNA相對表達(dá)水平均升高，而DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA相對表達(dá)水平則下降，提示不同濃度姜黃素處理均可通過抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶活性(主要為DNMT1)促進(jìn)肺癌細(xì)胞TFPI-2基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)TFPI-2基因的DNA甲基化，且從TFPI-2基因甲基化狀態(tài)亦可準(zhǔn)確反映姜黃素對肺癌細(xì)胞去甲基化作用。肖海勵等[20]研究認(rèn)為，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等具備活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可參與DNA甲基化并維持過程，且在正常細(xì)胞中呈現(xiàn)共同表達(dá)的形式，進(jìn)一步佐證本研究的正確性。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT可升高癌細(xì)胞ROS水平引發(fā)線粒體和核DNA損傷發(fā)揮抗癌作用，且可通過P53-P21/GADD45A-cyclin/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)-Rb/E2F-DNMT1軸介導(dǎo)去甲基化作用。而姜黃素與DNMT巰基共價結(jié)合使得轉(zhuǎn)移位點減少，從而對甲基化轉(zhuǎn)移及修飾產(chǎn)生阻礙，進(jìn)而取得去甲基化作用[21-25]。Cao等[26]研究表明，賴氨酸特異性去甲基化酶2(histone lysine specific demethylase 2，LSD2)可通過調(diào)節(jié)TFPI-2表達(dá)促進(jìn)小細(xì)胞肺癌增殖。

綜上所述，姜黃素可通過抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶活性來抑制TFPI-2基因甲基化，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖，且濃度為 40 μmol·L-1時抑制效果最佳。該研究為后續(xù)肺癌臨床治療方案制定提供參考，但尚有以下不足，即體外腫瘤狀態(tài)與體內(nèi)有所差異，因而姜黃素去甲基化作用還有待更多研究支持。且姜黃素生物利用度低，穩(wěn)定性差，機(jī)體代謝迅速等缺點可影響臨床應(yīng)用，應(yīng)著眼研究穩(wěn)定性更高的姜黃素系列衍生物的去甲基化作用，以使姜黃素成為肺癌治療的可靠靶向藥物。