張曦昊 詹 陽

1(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

2(中國科學技術大學納米科學技術學院 蘇州 215127)

1 引 言

人類大腦約有 1 000 億個神經(jīng)元，它們之間通過復雜的動作電位傳遞信息[1]。大腦作為人體復雜的器官之一，人們對其功能和作用機制的了解依然不足，大腦的功能機制研究仍是當今熱門的科研領域之一[2-4]。近年來，自由活動的清醒動物的大腦中，各個相關腦區(qū)群體神經(jīng)元的活動規(guī)律成為神經(jīng)科學研究的熱點。在體多通道電生理技術是記錄神經(jīng)活動的一種重要手段，該技術憑借其諸多優(yōu)勢已廣泛應用于神經(jīng)科學研究中[5-7]。在動物清醒、自由活動的狀態(tài)下，利用在體多通道電生理技術不僅可以觀察目的腦區(qū)神經(jīng)元的活動狀態(tài)，使記錄的神經(jīng)元信號和正常生理狀態(tài)下一致，還可以記錄具體腦區(qū)的數(shù)百個神經(jīng)元活動[8-10]。一般來說，研究人員使用在體多通道電生理技術，同時記錄實驗動物的電生理數(shù)據(jù)和行為學數(shù)據(jù)，以探究動物特定行為下的腦區(qū)活動情況。該技術主要包括電極的設計與組裝、電極埋植、電生理數(shù)據(jù)記錄以及電生理數(shù)據(jù)分析等步驟[11]。

近年來，為提升實驗精度，提高實驗效率，3D 打印的驅(qū)動及輔助裝置已應用于神經(jīng)電極的植入實驗中[12-13]。用于神經(jīng)記錄的微絲探針也出現(xiàn)了集成度更高的絞合方法[14]，本文將新的集成度較高的電極支架制作方法應用于多通道在體記錄中。雖然新型神經(jīng)電極已經(jīng)在精度[15]、器件化[16]、柔性化及功能化[17-21]等方面取得了很大的進展，但本文所使用的方法仍具有價格低廉、制作方便等優(yōu)勢，新型電極如 neuropixels 售價在萬元左右，本文的電極則采用四電極技術[22]，單個制作成本僅 500 元左右。在多通道在體記錄的相關實驗中，電極的制作是關鍵步驟，而電極支架作為電極的主體部分尤為重要，其具有支撐、黏附連接器、組裝電極絲和步進的作用。在傳統(tǒng)方法中[23]，電極支架的制作需要 PCB板、銅柱、環(huán)氧樹脂等材料，部件較為零散。針對其制作過程存在步驟煩瑣、一體化程度低、精度不高等問題，本文提出了一種新的電極支架制作方法，使得電極支架一體化程度和精度更高，重量更輕，節(jié)省了制作時間。此外，本文還進行了動物實驗，并對實驗結果進行了驗證。

2 材料和方法

2.1 實驗動物

本研究的動物飼養(yǎng)條件和實驗方案經(jīng)中國科學院深圳先進技術研究院動物倫理委員會審查通過(受理號:SIAT-IRB-170811-NS-ZY-A0367)。實驗選用年齡為 8～13 周的 C57BL/6J 雄鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)。動物飼養(yǎng)在小鼠中央排風通氣籠盒系統(tǒng)中，人為控制小鼠生活的燈光環(huán)境為 12 h 光照/12 h 黑暗。小鼠飼養(yǎng)房間內(nèi)的光照強度為 15～20 lux(光照時間為 8:00～20:00，自動控制)，設施內(nèi)設定溫度為(23±2)℃，濕度為 40%～70%。

2.2 電極支架制作方法

為簡化電極支架的制作流程，本文嘗試了新的電極支架制作方法。新的支架結構采用光敏樹脂-國產(chǎn) 9400，用以替換傳統(tǒng)結構中的印制電路板(Printed Circuit Boards，PCB 板)與銅柱。在傳統(tǒng)結構中，需要手動將 PCB 板與銅柱進行組裝，然后用氧樹脂膠熱封，具體操作可參考馬曉宇等的方法[23]。由于手工制作過程較為煩瑣，且可能導致誤差，因此本文利用 3D 打印技術重新設計制作了電極支架。

2.3 有限元分析

有限元分析是利用數(shù)學近似的方法對真實的物理系統(tǒng)(幾何和載荷工況)進行模擬。利用相互作用的元素(即單元)，就可用有限數(shù)量的未知量去逼近無限未知量的真實系統(tǒng)[24]。將電極支架的結構信息導入有限元分析軟件 ANSYS 中，依托實驗材料設置參數(shù)(表 1)，即可根據(jù)具體的實驗對其結構進行模擬仿真。

表1 9400 樹脂材料參數(shù)Table 1 9400 resin material parameters

2.4 埋置電極手術

為驗證電極的實用性，本文進行了相應的動物實驗。如圖 1(a)所示，向小鼠腹腔注射60 mg/kg 體重劑量的 1% 戊巴比妥鈉，用以麻醉實驗小鼠。待動物進入深度麻醉狀態(tài)后，去除頭部皮毛，剪開頭皮，將實驗小鼠固定在立體定位儀上，涂上眼膏，調(diào)平小鼠腦袋，確定海馬 3 區(qū)(CA3)的坐標(A/P:－2.06 mm；M/L:2.30 mm)并用黑色油性筆標記后，用顱鉆鉆開電極洞。在前囟前和后囟后面分別鉆一個孔，將連有地線和參考線的顱釘擰入顱骨。在顱骨中縫兩側合適的位置分別鉆一個洞，以制作電極支架的基層，并將顱釘旋入顱骨。先用 502 膠水固定顱釘，待 502 膠水凝固后，用牙科水泥將 4 顆顱釘包裹起來形成環(huán)形基座。用尖鑷挑破電極洞內(nèi)的硬腦膜，本次記錄腦區(qū)為 CA3，調(diào)整電極位置，電極置入深度為 2.35 mm。用液體石蠟和固體石蠟混合物將電極洞封住，然后利用比例適當且均勻混合的牙科水泥，將環(huán)形基座和電極支架的下層板粘合在一起，待牙科水泥變硬后，將顱骨和連接器的地線、顱骨和連接器的參考線分別焊接在一起。在整個電極支架的四周緊密包圍上銅網(wǎng)，并在銅網(wǎng)上涂上稀釋的牙科水泥，待牙科水泥完全凝固后，用膠帶將整個電極支架纏繞起來，露出連接器，防止蘇醒后的小鼠破壞電極絲，且可避免灰塵進入，電極埋植完成后的小鼠如圖 1(b)所示。將小鼠放在加熱墊上等待蘇醒，待小鼠恢復一周后，對小鼠進行電生理信號記錄。

圖1 電極埋植手術展示圖Fig. 1 Electrode implantation operation display

2.5 神經(jīng)元在體記錄

本實驗使用的記錄設備為美國 Plexon 公司的128 通道在體電生理記錄系統(tǒng)。每根電極記錄的神經(jīng)放電信號經(jīng)微電極放大器放大后分為兩路，一路負責記錄神經(jīng)元的胞外動作電位(采樣頻率為 40 kHz)，另一路負責記錄局部腦區(qū)的場電位(采樣頻率為 1 kHz)。上機觀察時，應根據(jù)所觀察腦區(qū)的場電位特征和神經(jīng)元放電特征，決定是否推進記錄電極。在步進電極的操作中，控制每次步進的距離為 50 μm 左右，每次電極推進后，等候數(shù)小時再進行下次推進，以防止腦組織形變回彈而錯過記錄腦區(qū)。通常電極經(jīng)過的地方神經(jīng)元會失活，因此記錄電極只進不退。

3 結果與討論

3.1 新型電極支架的設計與組裝

本文提出的新型電極支架是在馬曉宇等[23]的電極結構基礎上，根據(jù)現(xiàn)有的實驗需求，重新進行了設計。對結構優(yōu)化后整體建模，使得新電極支架的一體化程度更高，并利用光固化打印機批量制作電極支架。本文對電極支架的制作步驟亦進行了優(yōu)化，使其組成部件更少，如圖 2 所示。其中，圖 2(a)為改進前使用 PCB 板、銅柱的電極支架結構，圖 2(b)為本文采用新技術的支架結構。改進前的結構，需要手動將銅柱鑲嵌入 PCB板中，并用環(huán)氧樹脂膠熱封連接處，過程煩瑣復雜。本文新設計的電極支架結構如圖 3 所示，其包括上層蓋板結構 C 和下層主體部分。該支架通過 4 根圓柱連接電極支架下層的兩層板，使結構更加牢固，當受力時，在豎直方向上產(chǎn)生的應變更小。圖 4 為部件組裝過程示意圖，圖 5 為初步完成組裝的電極支架實物圖，其中，孔洞的大小和位置可根據(jù)不同的實驗要求進行調(diào)整，該支架還可用于光電極的相關實驗中。

圖2 電極支架組件新舊對比圖Fig. 2 Comparison of old and new electrode holder assembly

圖3 電極支架結構示意圖Fig. 3 Schematic diagram of electrode structure

圖4 部件組裝示意圖Fig. 4 Component assembly diagram

圖5 電極支架實物圖Fig. 5 A finished electrode array

在電極組裝過程中，如圖 3 所示，首先將螺母放在 B 板的 d 孔上，將螺絲從 A 板上層穿過 a孔螺母后，從 B 板的 d 孔穿出，將硅管粘滯在一起后穿過 AB 板的 b、e 孔洞，與螺母用卡夫特強力 AB 膠粘滯在一起，此時，從 A 板的 a 孔上使用螺絲刀轉(zhuǎn)動螺絲，可觀察到隨著螺絲刀的順逆時針轉(zhuǎn)動，螺母帶著硅管上下移動；其次，將 C板直接通過對應的孔洞蓋在 A 板上端，與圓柱連接的孔洞處用 502 膠水粘封后，將連接器用 AB膠粘在 AC 板的側邊；再次，使用鉑銥電極絲制作四電極，穿入預先粘滯在一起的硅管中，將電極絲尖端過火去除絕緣部分后，繞在連接器的引腳上，用銀漆點涂每個引腳，使電極絲與連接器之間的連接更加緊密，再將地線分別焊接在連接器的最末端對角線處；最后，使用 1∶1 混合均勻的 AB 膠封裝連接器、電極絲、地線即可。

3.2 模型受力分析

本小節(jié)將模擬步進過程中支架結構可能發(fā)生的變化，并對其進行分析。在步進時，實驗人員對電極支架施加一個力轉(zhuǎn)動螺絲，以達到步進的效果。若模擬支架的結構發(fā)生形變，那么可能影響實驗中腦區(qū)定位的準確性，因此，本文對該情況下支架可能發(fā)生的形變進行了模擬。在步進過程中，螺絲刀向下轉(zhuǎn)動步進螺絲時可能會對結構施加一個力，施力過程可以模擬為:在 a 孔邊緣的螺帽處施加一個圓環(huán)形法向的壓力的過程。電極支架的結構材料為 9400 樹脂，具體參數(shù)如表 1所示。當步進壓力F＝1 N 時，模擬支架結構可能發(fā)生的形變?nèi)鐖D 6 所示。結果表明，結構上層板在壓力作用下，沿負Z軸方向的最大形變?yōu)?.013 mm(圖 7)。在體多通道電生理記錄實驗中，對帶有電極的小鼠施加的步進壓力通常較小，以防止對動物造成不可逆的損傷。當壓力為 1 N時，支架結構形變很小，幾乎不會對實驗結果產(chǎn)生影響。在以往使用的電極中，下層結構是用環(huán)氧樹脂將銅柱和 PCB 板粘合而成，結構連接處使用熱封的環(huán)氧樹脂膠水，膠水的用量、熱封溫度、膠水的配比等都會影響整體結構參數(shù)。此外，將零散部件結合在一起的一體化程度較低，且連接處力學參數(shù)不能確定，不便進行力學分析，而改進后的結構一體化優(yōu)勢可避免上述問題。

圖6 F＝1 N 時支架結構受力示意圖Fig. 6 Simulation diagram for the applied force when F＝1 N

圖7 F＝1 N 時結構形變效果圖Fig. 7 Simulation of the structural deformation when F＝1 N

3.3 結構質(zhì)量對比

將本文電極支架與傳統(tǒng)電極支架的質(zhì)量進行對比，經(jīng)多組稱量后比較可知(圖 8 為其中一次稱量比較的結果)，與傳統(tǒng)電極支架質(zhì)量[23]相比，本文電極支架的質(zhì)量降低了 60% 左右。支架重量的降低在一定程度上可減輕實驗動物的負重，從而減少電極質(zhì)量對實驗動物活動靈活性的影響。

圖8 新舊電極支架質(zhì)量對比圖Fig. 8 Weight comparison for the traditional electrode and the novel electrode

3.4 信號記錄

待實驗動物術后恢復大約一周，再進行后期行為訓練或電生理信號記錄實驗。實驗開始前，將小鼠用毛巾或棉花輕輕握在手心，待小鼠安靜并適應實驗人員的實驗操作后，將小鼠腦袋上纏繞在電極上的膠布解開，并檢查是否有木屑掉入電極連接器中，做好電極連接器的清理工作。將Plexon 系統(tǒng)的連接器與小鼠頭上的電極連接器相連接，檢查是否連接穩(wěn)定。在正式電生理信號記錄實驗前 2～3 d，對小鼠重復上述操作，保證小鼠在實驗時能夠自由活動。打開 ominiplex(電生理信號記錄軟件)和 cineplex studio(行為學視頻記錄)軟件，分別在兩個軟件中設置好記錄參數(shù)，點擊開始記錄。圖 9 為截取的一段小鼠電生理活動信號，獲取電生理信號數(shù)據(jù)后，在 offline sorter 軟件中，對全波段 wideband 原始數(shù)據(jù)做高通濾波，使用閾值檢測法，神經(jīng)元放電長度為 1 400 μs，脈沖間隔為 1 ms，信號檢測閾值為 5 SD(standard deviation)。首先，提取滿足檢測標準的信號，得到神經(jīng)元放電在時間軸上的集合；然后選擇主成分分析方法提取神經(jīng)元放電的不同特征；最后使用 offline sorter 軟件中的聚類算法k-means，進行神經(jīng)元的聚類分析，神經(jīng)元分類的標準參考主成分分析的分類情況和類內(nèi)距離L-ration 以及類間距離 Isolatioin Distance兩個值的大小。后續(xù)具體分析參考徐佳敏等和Schmitzer-Torbert 等的方法[25-26]。

圖9 使用新型記錄電極得到的神經(jīng)元活動信號Fig. 9 Spiking activities from the tetrode recordings using the novel electrode

4 結 語

結合具體實驗，本文制作出一種用于長期神經(jīng)元放電記錄的一體化可步進植入式神經(jīng)電極支架。該支架簡化了電極的制作流程，提高了支架結構的精度和一體化程度，提升了實驗效率。此外，還減輕了電極的質(zhì)量，可一定程度上減輕實驗鼠的負重，減少電極對實驗鼠自由活動的影響。通過動物實驗驗證，該支架可正常記錄小鼠的電生理活動。若確定了具體的實驗腦區(qū)，就可批量制作該電極支架，還可根據(jù)不同的實驗目的進行定制。通過改變孔洞的半徑和位置，可同時記錄不同腦區(qū)的電生理信號；通過適當?shù)慕Y構改變，還可將該電極支架應用于光遺傳實驗中。