周志兵 魏文嵩 吳曉波 駱 萍 金玉梁 周新華 江期華

江西省南昌市第三醫(yī)院 330009

乳腺癌是全世界婦女死亡的主要原因之一，2018年全球女性乳腺癌發(fā)病率46.3/105，死亡率13.0/105，均呈上升趨勢[1]，也是我國女性最常見的癌癥。臨床上，大多數(shù)乳腺癌亞型表達(dá)雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2，是乳腺癌分型和藥物選擇的常用生物標(biāo)志物[2]。然而，三陰性乳腺癌(TNBC)缺乏生物標(biāo)記物表達(dá)，占所有乳腺癌的15%～20%[3]。研究表明，TNBC比其他亞型更具攻擊性，對(duì)化療/放療更具抵抗力，有更高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，總體生存期更短[4]。因此，TNBC患者需要新的治療策略。最近研究表明，表觀遺傳因子在染色質(zhì)水平上通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的免疫原性、可塑性和異質(zhì)性[5]。研究這些表觀遺傳調(diào)控因子或識(shí)別由其介導(dǎo)的相關(guān)分子和信號(hào)通路，可能為開發(fā)新一代抗癌藥物另辟蹊徑。CHD4是核小體重構(gòu)和組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物的最大亞單位，在控制同源重組修復(fù)以維持基因組穩(wěn)定性方面不可或缺。研究顯示，CHD4還與多種致癌作用有關(guān)，包括誘導(dǎo)異常干細(xì)胞更新、減緩分化和改變細(xì)胞周期的控制[6]，CHD4可介導(dǎo)TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，也可能是TNBC患者的預(yù)后生物標(biāo)記物[7]。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)直接靶向CHD4的藥物，CHD4介導(dǎo)的下游基因及相關(guān)信號(hào)通路尚不清楚。本研究利用新一代測序(NGS)和生物信息學(xué)工具，探索CHD4激活的下游基因和新的信號(hào)通路，可有助于研發(fā)針對(duì)CHD4高表達(dá)TNBC患者的靶向藥物。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析

1.1.1 從GEPIA2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)：GEPIA2具有198 619種亞型和84種癌癥亞型，從基因水平擴(kuò)展到轉(zhuǎn)錄本水平將基因表達(dá)量化，支持對(duì)特定癌癥亞型的分析和亞型之間的比較。GEPIA2整合了來自(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和GTEx項(xiàng)目中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，提供了多種數(shù)據(jù)分析和可視化功能(見圖1)。

圖1 GEPIA2 數(shù)據(jù)庫中CHD4基因在不同癌癥組織中的表達(dá)情況

1.1.2 Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫分析蛋白表達(dá)水平：HPA(Human Protein Atlas)數(shù)據(jù)庫是基于蛋白組學(xué),轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)，提供了26 000種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息。不僅收錄了腫瘤組織，也涵蓋了正常組織的蛋白表達(dá)情況，而且還可以查閱腫瘤患者的生存曲線。該數(shù)據(jù)庫整合了腫瘤基因圖譜,可以看到TCGA表達(dá)情況(見圖2)。

圖2 CHD4在乳腺組織細(xì)胞類型分布

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究以丙二醛-MB-231、丙二醛-MB-468、Hs578T和4T-1三陰性乳腺癌細(xì)胞系(ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國)為研究對(duì)象。細(xì)胞在杜爾貝科改良的Eagle 中型培養(yǎng)基(Thermo Fisher科學(xué)公司，沃爾瑟姆市，馬薩諸塞州，美國)中培養(yǎng)。RNA提取，全基因組轉(zhuǎn)錄組鑒定，RNA測序表達(dá)譜分析。用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)按制造商的方案從親代穩(wěn)定敲除CHD4(shCHD4)4T-1細(xì)胞中提取總RNA，后由Genewiz公司進(jìn)行后續(xù)分析。雙親細(xì)胞和shCHD4細(xì)胞的mRNA在倍變>2.0和每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)(FPKM)>0.2時(shí)有差異表達(dá)。

1.3 創(chuàng)新路徑分析(IPA) IPA(Ingenuity Systems，Inc.，Redwood City，CA，USA)是一款基于多種類型文獻(xiàn)的網(wǎng)絡(luò)軟件，由專家評(píng)審和更新，可用于“組學(xué)實(shí)驗(yàn)”數(shù)據(jù)的分析、集成和解釋，可獲得功能分析、典型路徑、上游分析和網(wǎng)絡(luò)[8]。IPA軟件還提供了因果分析，幫助用戶根據(jù)基因數(shù)據(jù)集和數(shù)據(jù)比較的結(jié)果生成假設(shè)的信號(hào)通路。

1.4 RNA干擾轉(zhuǎn)染 人類CHD4、β1整合素和陰性對(duì)照的短鏈RNA(siRNA)均購自美國達(dá)摩康公司。根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000和Opti-MEM(Invitrogen)將非靶向或特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.5 定量即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR) 用三唑試劑提取總RNA，并根據(jù)制造商的Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用作PCR擴(kuò)增的模板，引物包括人CHD4、人β1整合素、人GAPDH、小鼠CHD4、小鼠β1整合素和小鼠GAPDH。采用羅氏LightCycler 480Ⅱ系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，進(jìn)行全滴定實(shí)時(shí)PCR?？贵w β1整合素(#9699)和GAPDH(#2118)購自細(xì)胞信號(hào)技術(shù)(Danvers，MA，USA)。CHD4(GTX124186)和β1整合素(GTX128839)購自特克斯基因國際公司。

1.6 蛋白印跡法 用M-PERTM哺乳動(dòng)物蛋白提取緩沖液，對(duì)細(xì)胞裂解，離心，去碎片。提取的蛋白質(zhì)定量，變性，用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用所示抗體免疫印跡。

1.7 人體標(biāo)本 收集南昌市第三醫(yī)院病理科102例TNBC患者的福爾馬林固定石蠟包埋組織塊,均經(jīng)醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)使用這些組織。數(shù)據(jù)匿名分析，故無須額外知情同意。所有操作方法均取得南昌市第三醫(yī)院認(rèn)可。

1.8 免疫組織化學(xué)染色及評(píng)分 石蠟包埋組織塊切片，脫蠟并重新水合，浸入pH 6.0回收溶液，并在121℃高壓滅菌，提取抗原。在3%過氧化氫中孵育，樣品在室溫下與初級(jí)抗體孵育1h，然后應(yīng)用DAKO RealTMEnvivonTM檢測體系1h。最后，將切片與3’，3-二氨基聯(lián)苯胺孵育，用邁爾蘇木素復(fù)染，固封，分析。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度(0，1+，2+，3+)和陽性細(xì)胞比例(0:≤10%，1:>10%且≤25%，2:>25%且≤50%，3:>50%)對(duì)樣本進(jìn)行評(píng)分。分?jǐn)?shù)≤4和≥6分別定義為低表達(dá)和高表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。IHC染色法測定TNBC患者CHD4和β1整合素的表達(dá)，用χ2檢驗(yàn)比較。采用Kaplan-Meier法分析生存曲線，評(píng)價(jià)這些蛋白表達(dá)作為TNBC患者預(yù)后指標(biāo)的可行性。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估整體生存率與臨床病理變量的單變量和多變量比較。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各組間差異。P值<0.05表明兩組間差異有統(tǒng)主進(jìn)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常4T-1腫瘤細(xì)胞和shCHD4 4T-1腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)差異性 親代和shCHD4 4T-1細(xì)胞中的差異表達(dá)基因在圖3中顯示為火山圖。cuff-diff分析結(jié)果顯示540個(gè)顯著差異表達(dá)基因。shCHD4 4T-1細(xì)胞中有283個(gè)基因上調(diào)，257個(gè)基因下調(diào)。

圖3 親代和shCHD4 4T-1細(xì)胞中的差異表達(dá)基因

2.2 CHD4障礙的信號(hào)傳導(dǎo)通路失調(diào)與整合素信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān) 應(yīng)用IPA方法對(duì)shCHD4t-1細(xì)胞中257個(gè)下調(diào)基因分析，有500多條信號(hào)通路參與了CHD4的相關(guān)通路。受CHD4抑制影響的前10個(gè)信號(hào)通路包括Snail1、Notch1、SMARCA4、JUN、VCAM1、BRD4、CD4、IL-4、MYC和Snail2。因此，筆者關(guān)注CHD4在整合素信號(hào)通路中的作用。

2.3 CHD4基因敲除降低小鼠和人TNBC細(xì)胞β1整合素基因和蛋白表達(dá) q-PCR結(jié)果顯示，CHD4基因敲除后，TNBC細(xì)胞β1整合素基因表達(dá)下降。然而，β1整合素的敲除并不影響CHD4基因的表達(dá)。此外，在其他人TNBC細(xì)胞中也觀察到CHD4基因敲除導(dǎo)致β1整合素蛋白表達(dá)減少。因此，CHD4可能是β1整合素的上游介質(zhì)，β1整合素蛋白表達(dá)下調(diào)可能是CHD4基因調(diào)控的結(jié)果。

2.4 β1整合素是CHD4調(diào)控小鼠TNBC細(xì)胞的重要分子 本文NGS數(shù)據(jù)中，β1整合素不僅參與了整合素信號(hào)傳導(dǎo)，而且參與了其他幾種受到CHD4調(diào)節(jié)的途徑。此外，系統(tǒng)分析表明CHD4通過與候選蛋白Snail1、Notch1、SMARCA4、JUN、VCAM1、BRD4、CD4、IL-4、MYC和Snail2相互作用，上調(diào)β1整合素的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明CHD4在調(diào)節(jié)β1整合素基因表達(dá)中起轉(zhuǎn)錄激活作用。

2.5 TNBC患者CHD4、β1整合素與若干臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 本研究中，NGS和體外數(shù)據(jù)表明β1整合素由CHD4介導(dǎo)，然而，CHD4-β1整合素軸在TNBC患者中是否重要尚不清楚。采用IHC染色法研究TNBC患者CHD4、β1整合素及兩者共表達(dá)與其他臨床病理參數(shù)的關(guān)系。102例TNBC患者CHD4與β1整合素呈正相關(guān)(P=0.006)，見表1。

表1 TNBC組織中CHD4和β1整合素表達(dá)相關(guān)性

CHD4、β1整合素、CHD4和β1整合素的表達(dá)與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡顯著相關(guān)。Kaplan-Meier分析也顯示CHD4和β1整合素共表達(dá)患者的平均總生存期為(28.7±13.2)個(gè)月，此值明顯低于其他組平均生存期為(46.5±29.3)個(gè)月。CHD4和β1整合素的共表達(dá)在各組間生存時(shí)間最短。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，患者的總生存率與CHD4和β1整合素的共表達(dá)顯著相關(guān)。通過ROC曲線分析，CHD4和β1整合素的共表達(dá)與生存率的正相關(guān)性顯著高于CHD4和β1整合素(AUC分別為0.74、0.73、0.72)，見圖4。

圖4 CHD4、β1整合素以及CHD4和β1整合素的共同表達(dá)的ROC曲線分析

綜合以上數(shù)據(jù)表明CHD4和β1整合素的共同表達(dá)是TNBC患者總生存率的重要獨(dú)立預(yù)測因子。

3 討論

TNBC缺乏特異性生物標(biāo)記物、治療方案少、新型抗癌藥物開發(fā)緩慢，導(dǎo)致TNBC患者生存率低。因此，尋找新的診斷、預(yù)后和藥物開發(fā)的靶點(diǎn)是治療TNBC的重要問題。先前的研究表明，CHD4與許多癌癥的致癌作用有關(guān)[6]。此外，CHD4在生理功能上與核小體重塑的其他核心亞單位和組蛋白dea-乙?；笍?fù)合物相互作用，維持抑癌基因表達(dá)[9]。以前的研究也表明CHD4介導(dǎo)的p21和E-cadherin抑制可誘導(dǎo)乳腺癌的化療耐藥性和轉(zhuǎn)移[7]。然而，迄今為止還沒有開發(fā)出針對(duì)CHD4的抗癌藥物。因此，迫切需要尋找其他可能引起類似CHD4缺乏癥的下游分子或臨床前藥物。

在對(duì)CHD4介導(dǎo)的分子或通路的研究中，發(fā)現(xiàn)整合素信號(hào)通路受CHD4基因敲除的影響。β1整合素不僅參與CHD4調(diào)控基因的整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且參與CHD4調(diào)控基因的許多其他途徑，表明β1整合素可能是一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)控因子介導(dǎo)的分子。當(dāng)β1整合素基因敲除時(shí)，CHD4抑制基因敲除和β1整合素蛋白表達(dá)，并不影響CHD4蛋白表達(dá)，提示CHD4是β1整合素的上游介質(zhì)。通過IPA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)10種可能的介質(zhì)參與了CHD4對(duì)β1整合素的調(diào)節(jié)。以往的研究表明，Snail、BRD4、Notch和Myc等介導(dǎo)因子可以直接或間接地與CHD4結(jié)合，使多種抑癌基因表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤功能。一些研究表明β1整合素也可以被這些分子調(diào)節(jié)[10]。然而，TNBC中CHD4-β1整合素軸介導(dǎo)的主要介質(zhì)和確切機(jī)制尚需進(jìn)一步分析。CHD4還可以通過多種免疫應(yīng)答因子調(diào)節(jié)β1整合素。因此，這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能應(yīng)用于癌癥治療中的免疫治療[11]。

以往的研究中，β1整合素及其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、存活和耐藥等。此外，β1整合素的高表達(dá)與幾種癌癥的不良預(yù)后相關(guān)[12]。β1整合素的破壞可能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤和非依賴性生長。研究表明，β1整合素是TNBC中潛在的預(yù)后生物標(biāo)記物[10]，一些臨床前試驗(yàn)支持β1整合素拮抗劑可能是抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的化療藥物[11]。然而，β1整合素拮抗劑能否進(jìn)一步應(yīng)用于高表達(dá)CHD4的TNBC患者尚不清楚。因此，我們探討了CHD4與β1整合素的共表達(dá)與多種臨床病理因素的關(guān)系。本文數(shù)據(jù)表明CHD4與β1整合素呈正相關(guān)。先前的研究也表明CHD4和β1整合素可能是TNBC患者的預(yù)后標(biāo)志物[7]。因此，CHD4和β1整合素在TNBC中的作用應(yīng)比乳腺癌其他亞型更為重要。CHD4和β1整合素的聯(lián)合表達(dá)與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡顯著相關(guān)，可能是總生存率的重要預(yù)測因子。此外，ROC曲線分析，CHD4和β1整合素的共表達(dá)與生存率的正相關(guān)顯著高于CHD4和β1整合素。因此，CHD4-β1整合素在TNBC患者中具有臨床病理和預(yù)后意義，提示β1整合素拮抗劑可進(jìn)一步應(yīng)用于高CHD4表達(dá)的TNBC患者。

綜上所述，CHD4-β1整合素可能是TNBC患者的一個(gè)預(yù)后標(biāo)志物，β1整合素抑制劑的使用可能是CHD4高表達(dá)TNBC患者的治療選擇。