張 黎，譚 凡，鄭龍龍

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801

豬鏈球菌（Streptococcus suis）廣泛存在于自然界，是生豬生產(chǎn)過程中極易發(fā)生的傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。病豬常出現(xiàn)腦膜炎、急性敗血癥等癥狀，嚴(yán)重影響豬的健康生長(zhǎng)，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年來，豬鏈球菌病在國(guó)內(nèi)某些地區(qū)暴發(fā)流行，傳播速度快、發(fā)病率和死亡率高，大多數(shù)呈垂直和水平傳播[1]。根據(jù)S.suis菌體莢膜抗原特性分為不同的血清型，其中以豬鏈球菌血清2型（Streptococcus suisserotype 2，SS2）流行最廣，對(duì)豬的致病性最強(qiáng)[2]。特別是敗血型S.suis是山西省SS2 中危害最為嚴(yán)重的菌株[3-4]，青年豬發(fā)病突然，病程短、死亡率高，且與非洲豬瘟臨床癥狀相似，對(duì)養(yǎng)殖戶造成巨大的恐慌和經(jīng)濟(jì)危害。

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）基因是SS2 高度保守的毒力基因，能與感染致病性SS2 的豬陽性血清反應(yīng)；同時(shí)，基因特異性高，能夠與其他血清型區(qū)分，因此GDH 常作為SS2 GDH 診斷抗原用于S.suis血清型的鑒別[5-7]。敗血型S.suis發(fā)病急，且臨床和死亡癥狀與非洲豬瘟有一定的相似，現(xiàn)場(chǎng)剖檢取組織散毒的風(fēng)險(xiǎn)較大。發(fā)生敗血癥時(shí)血液中常含有大量的致病菌，是分離致病菌的良好材料。因此，本研究使用抗凝管無菌取尾根血和耳靜脈血并混合，進(jìn)行病原診斷和藥敏試驗(yàn)，為該病的臨床診療提供新思路和用藥參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和主要試劑

50 日齡12～15 kg 仔豬（n=10）于早晨巡欄時(shí)未見任何異常癥狀，飼喂0.5～1.0 h 后陸續(xù)出現(xiàn)角弓反張、嘶叫、全身顫抖或頸部僵直，偏頭或呈一個(gè)方向打轉(zhuǎn)劃等臨床癥狀。眼結(jié)膜充血，流淚有少量膿性分泌物，有漿液性鼻汁，使用鎮(zhèn)靜劑氯丙嗪和高糖靜脈注射及肌肉注射磺胺嘧啶鈉、恩諾沙星3 d后，4 頭仔豬于發(fā)病第3～5 天逐漸開始恢復(fù)，但仍有行動(dòng)障礙，2 頭仔豬不能站立；4 頭仔豬死亡（發(fā)病第1 天死亡2 頭，第2 天和第3 天各死亡1 頭）。發(fā)病豬未用藥時(shí)使用抗凝管取尾根血和耳靜脈血各100～200 μL 并混合，4 ℃保存送檢。樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、PCR 分型鑒定和藥敏試驗(yàn)。EasyTap 聚合酶（北京全式金）；DL1 000 Marker（Biomed），其他化學(xué)試劑均從Sigma-Aldrich 公司購買。

1.2 試驗(yàn)方法

1）SS2 分離培養(yǎng)。每100 μL 抗凝血加入200 μL 綿羊血液體培養(yǎng)基，37 ℃ 50 r/min 振蕩4 h，取100 μL 增菌液涂布于綿羊血固體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍形成的溶血環(huán)。

2）SS2 革蘭氏染色。取形成溶血環(huán)的SS2 疑似菌落，參考杭州微生物試劑有限公司革蘭氏染色液操作說明，進(jìn)行革蘭氏染色。

3）SS2 總DNA 提取和PCR 鑒定。刮取上述鑒定過的SS2 疑似菌落，每個(gè)樣品取5 個(gè)菌落，加50 μL 溶菌酶溶液靜置5 min，沸水裂解5 min；4 ℃靜置10 min 后作為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)，測(cè)定SS2GDH基因。根據(jù)Kutz 等[8]建立的SS2GDH基因（Genbank：AF229683），設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度為439 bp的特異性引物。GDH-F：5’-CCTTGGTCATGCAC CAAACC-3’，GDH-R：5’-CCTGTTTTTGAAGCAC ACCCAG-3’，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：55 ℃退火20 s，30 個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸5 min。

4）藥敏試驗(yàn)。刮取5 個(gè)經(jīng)本文“1.2.2）、1.2.3）”初步鑒定的SS2 分離菌株至1 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯振蕩混勻后，按常規(guī)細(xì)菌接種方法取菌液100 μL 均勻涂抹在MH 藥敏培養(yǎng)基上，并貼上標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片（直徑6 mm），37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

6 份樣品在綿羊血固體培養(yǎng)基上均有不同透明程度的β 溶血環(huán)，其中4 份陸續(xù)死亡的豬全血樣品引起的溶血更為明顯。疑似菌落呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落。

2.2 革蘭氏染色

形成溶血環(huán)的疑似菌落經(jīng)革蘭氏染色，菌體呈革蘭氏陽性，卵圓形菌體7～10 個(gè)呈短鏈狀排列；少數(shù)菌落的菌體15～20 個(gè)排成長(zhǎng)鏈。

2.3 PCR 鑒定

SS2GDH基因檢測(cè)結(jié)果顯示，5 例發(fā)病豬（用藥治療后死亡的4 頭豬、1 頭豬不能站立）呈陽性，SS2 陽性率占S.suis分離株的83.3%（5/6）。

2.4 藥敏結(jié)果

5 例SS2 分離株對(duì)恩諾沙星、大觀霉素、頭孢曲松鈉中度敏感（抑菌圈直徑分別為14、12、12 mm），對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素、替米考星、鏈霉素、阿莫西林均耐藥（抑菌圈直徑均為6 mm）。

3 討 論

本文采用全血對(duì)疑似S.suis感染引起的敗血癥發(fā)病豬進(jìn)行SS2 分離鑒定，并經(jīng)PCR 鑒定GDH毒力基因獲得5 株SS2，感染率為50%（5/10）。SS2分離株對(duì)恩諾沙星、大觀霉素、頭孢曲松鈉中度敏感，建議在飼料中添加恩諾沙星+林可大觀霉素進(jìn)行針對(duì)性預(yù)防，發(fā)病豬肌肉注射頭孢曲松鈉和氯丙嗪等藥物針對(duì)性治療。

S.suis對(duì)惡劣環(huán)境耐受型較強(qiáng)，污染養(yǎng)殖區(qū)后很難徹底清除，極易造成水平傳播，并不斷向場(chǎng)外擴(kuò)散。S.suis不僅病豬攜帶，健康豬攜帶率也高，而且存在多重耐藥和致病性強(qiáng)的菌株[9]。國(guó)內(nèi)研究者報(bào)道，采集江西省疑似S.suis感染病死豬的肺臟和關(guān)節(jié)液進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，分離株攜帶四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類以及磺胺類、氟喹諾酮類耐藥基因[10]。近期國(guó)內(nèi)已報(bào)道多起因SS2 引起的豬群發(fā)病死亡[11-13]，藥物防控效果不理想。從事生豬養(yǎng)殖與屠宰相關(guān)行業(yè)人員時(shí)有SS2感染[14]，該病需要人獸共治，加強(qiáng)從業(yè)者的重視。我國(guó)已研制出商品化的豬鏈球菌多價(jià)滅活菌、亞單位疫苗，采用疫苗進(jìn)行免疫接種能明顯降低SS2 引起的敗血性死亡，對(duì)該病的預(yù)防和控制有重要意義。