肖志文， 胡 帥， 金雪玲， 陳紅兵， 武 涌

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院， 江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院， 江西 南昌 330047；4.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 江西 南昌 330200;5.南昌大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科， 江西 南昌 330006)

腰果(AnacardiumoccidentaleLinn.)是被子植物門(Angiospermae)木蘭綱(Magnoliopsida)無(wú)患子目(Sapindales)漆樹科(Anacardiaceae)腰果屬(Anacardium)植物的果實(shí)，又稱槚如果。原產(chǎn)于西印度群島和巴西東北部，全球熱帶地區(qū)已廣泛引種栽培。腰果過(guò)敏是一種僅次于核桃過(guò)敏的常見堅(jiān)果過(guò)敏，其全球發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[1]。腰果在我國(guó)也是較為常見的致敏食物之一，研究表明腰果處于我國(guó)食入性過(guò)敏原的前3位[2-4]。腰果過(guò)敏臨床癥狀涉及多個(gè)器官或系統(tǒng)，根據(jù)國(guó)內(nèi)早期的病例報(bào)道，腰果過(guò)敏患者多表現(xiàn)為過(guò)敏性休克、體溫下降、全身瘙癢、腹部疼痛及呼吸困難等，甚至有因腰果過(guò)敏死亡的案例[5]。

腰果中過(guò)敏原蛋白主要分為3類：7S豌豆球蛋白(Ana o 1)、11S豆球蛋白(Ana o 2)和2S白蛋白(Ana o 3)。這3種蛋白被歸類為種子貯藏蛋白[6]，且都屬于I類食物過(guò)敏原[7]。其中，腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白是分子質(zhì)量為16.3 kDa的2S白蛋白，由5個(gè)α-螺旋組成，包含2個(gè)由半胱氨酸二硫鍵連接的亞基。國(guó)內(nèi)外已圍繞腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的純化進(jìn)行了相關(guān)的研究。迄今為止，Reitsma等[8]通過(guò)多步硫酸銨沉淀結(jié)合超濾法分離出腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白，Mattison等[9]采用硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)合羥基磷灰石低壓色譜系統(tǒng)純化出腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白。然而，目前腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白分離純化的效果較低，且分離過(guò)程復(fù)雜，而僅通過(guò)陰離子交換層析高效純化出高純度的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白尚未見報(bào)道。此外，通過(guò)腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的氨基酸序列預(yù)測(cè)其理論等電點(diǎn)為5.68，與另外兩種過(guò)敏原的預(yù)測(cè)等電點(diǎn)相差較大，故采用弱陰離子交換層析純化腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白。

熱加工會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，空間結(jié)構(gòu)展開、內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，從而促進(jìn)與其他物質(zhì)的相互作用，生成各種高聚物和交聯(lián)產(chǎn)物[10]，最終導(dǎo)致構(gòu)象型表位[11]、IgE結(jié)合表位和T細(xì)胞反應(yīng)[12]發(fā)生變化。如烘焙處理會(huì)使花生過(guò)敏原Ara h 2蛋白的分子結(jié)構(gòu)和核心表位發(fā)生改變[13]。目前的研究主要關(guān)注烘焙加工對(duì)腰果致敏性的影響，而對(duì)腰果主要過(guò)敏原Ana o 3蛋白的結(jié)構(gòu)變化及熱穩(wěn)定性的研究相對(duì)較少。食品工業(yè)中腰果常用加工方法主要是先經(jīng)150 ℃加熱25～35 min以去除外殼，而后120 ℃或160 ℃烘焙20 min，或93 ℃逐漸增加至135 ℃緩慢油炸35～40 min[14]。因此研究腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白在160 ℃熱處理過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化及穩(wěn)定性對(duì)研究腰果過(guò)敏具有重要意義。

本研究擬采用陰離子交換層析法開發(fā)一種腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的高效分離純化的方法，并利用小分子蛋白電泳(Tricine-SDS- PAGE)、液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC- MS/MS)和免疫印跡(Western Blotting)技術(shù)對(duì)分離純化的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白進(jìn)行鑒定，同時(shí)探究在腰果常用加工160 ℃條件下對(duì)腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白結(jié)構(gòu)的影響，旨在為腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、致敏性研究提供理論及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生腰果(已高壓蒸煮脫殼)，市售；人抗腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的IgE單克隆抗體E- 2F5，美國(guó)INDOOR公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Maker，美國(guó)Thermo公司；DEAE- Sepharose Fast Flow，美國(guó)GE公司；生物素標(biāo)記的羊抗人IgE，美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，欣博盛生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(2-amino-2-(hgdroxymethyl)-1,3-propanediol，Tris)、pH=7.2的磷酸鹽緩沖液、甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、過(guò)硫酸銨(ammonium persulphate，AP)、吐溫- 20(Tween-20)，北京索萊寶科技有限公司；四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色液、40%儲(chǔ)液(丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的水溶液)，上海生工科技公司；考馬斯亮藍(lán)R250，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜，美國(guó)PALL公司；氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉，西隴科學(xué)科技公司；封阻液，上海翌圣生物科技股份有限公司；3 kDa超濾管，德國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS- 3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器公司；1658004型迷你蛋白電泳儀、GS- 800型光密度掃描儀，美國(guó)Bio- Rad公司；Chemi XRQ型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Syngene公司；EPS- 601型電轉(zhuǎn)儀，美國(guó)GE公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；SCIENTZ- 10N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白純化系統(tǒng)，上海青浦滬西儀器廠；MOS- 450/AF- CD型色譜儀，法國(guó)Biologic公司；UV WinLab型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腰果粉的制備

取新鮮生腰果用高速粉碎機(jī)于液氮環(huán)境中粉碎至糊狀，稱取一定質(zhì)量的腰果糊于燒杯中，以m(腰果糊)∶V(提取溶劑)=1 g∶10 mL的比例加入沸程為30～60 ℃石油醚脫脂6 h；然后于4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min去除上清液，沉淀物再次脫脂，離心后于通風(fēng)櫥中自然干燥后即得脫脂腰果粉。脫脂腰果粉末于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2腰果粗蛋白的提取

稱取脫脂腰果粉，以m(脫脂腰果粉)∶V(提取溶劑)=1 g∶10 mL的比例加入pH=7.2的磷酸鹽緩沖液，在4 ℃條件下磁力攪拌12 h后，于4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液；取沉淀重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。上清液于蒸餾水中透析(透析袋截留分子質(zhì)量為6～8 kDa)，4 ℃磁力攪拌48 h，換液5次，透析完后經(jīng)冷凍干燥得到粗蛋白凍干粉。利用Bradford法測(cè)定蛋白濃度并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測(cè)定

稱取36.3 g Tris和0.3 g SDS溶于85 mL超純水中，用鹽酸調(diào)至pH=8.45后定容為100 mL制成凝膠緩沖液；稱取1.0 g AP粉末溶解于10 mL超純水中配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的AP溶液；將3 000 μL凝膠緩沖液，3 750 μL 40%儲(chǔ)液，2 250 μL超純水，30 μL AP溶液，3 μL TEMED混勻后配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.5%致密膠；將990 μL凝膠緩沖液，780 μL 40%儲(chǔ)液，960 μL超純水，99 μL AP溶液，1.5 μL TEMED混勻后配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%夾層膠；將1 125 μL凝膠緩沖液，450 μL 40%儲(chǔ)液，2 745 μL超純水，30 μL AP溶液，3 μL TEMED混勻后配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.5%濃縮膠；將50 mL甲醇、75 mL乙酸和875 mL超純水混勻配制成脫色液。

研究采用Tricine- SDS- PAGE電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.5%致密膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%夾層膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%濃縮膠進(jìn)行腰果過(guò)敏原Tricine- SDS- PAGE電泳分析，上樣量為10 μL，電泳條件為濃縮膠恒壓30 V，60 min；夾層膠和分離膠恒壓100 V，120 min。電泳結(jié)束后，膠塊用蒸餾水清洗5 min，固定液固定15 min，考馬斯亮藍(lán)染色15 min，而后用脫色液進(jìn)行脫色過(guò)夜。次日以GS- 800型光密度掃描儀進(jìn)行成像，并利用Quantity One軟件分析蛋白純度。

1.3.4腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的分離純化

采用DEAE- Sepharose Fast Flow柱材進(jìn)行弱陰離子交換層析以分離純化蛋白，層析柱內(nèi)徑為1.6 cm，長(zhǎng)度為30 cm。利用腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的氨基酸序列預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)約為5.68，為使蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合力強(qiáng)弱適中，緩沖體系pH值應(yīng)與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差一個(gè)單位，故選用pH值為6.8。用磷酸鹽緩沖液(將3.51 g十二水合磷酸氫二鈉和1.59 g二水合磷酸二氫鈉溶于2 000 mL蒸餾水配制成磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8的磷酸鹽緩沖液)平衡離子交換柱后，將腰果粗蛋白100 mg溶于5 mL平衡緩沖液后進(jìn)行上樣，并用磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8)洗脫未結(jié)合蛋白，待基線平衡后，用含0.1～0.3 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8)連續(xù)梯度洗脫，洗脫速度為2 mL/min，280 nm處檢測(cè)紫外吸收峰，收集各洗脫峰。利用Bradford法測(cè)定蛋白含量并計(jì)算腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的得率。

1.3.5腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的質(zhì)譜鑒定

將經(jīng)Tricine- SDS- PAGE電泳脫色后電泳膠上的目標(biāo)條帶裁切下來(lái)，保存于超純水中送至上海中科新生命有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.6腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的免疫印跡鑒定

稱取4.84 g Tris和58.48 g NaCl溶于850 mL超純水中，用鹽酸調(diào)至pH=7.5后定容為1 000 mL，而后向其中加入1 mL Tween 20，經(jīng)混勻后配制成洗滌緩沖液(tris-buffered saline and Tween 20，TBST)。

將Tricine- SDS- PAGE電泳未經(jīng)染色的電泳膠置于3層濾紙和NC膜中間，轉(zhuǎn)印程序設(shè)置如下：電壓為100 V，電流為400 mA，時(shí)間為1 h。轉(zhuǎn)印完成后將帶有蛋白的NC膜蛋白面朝上置于50 mL離心管中，加入10 mL封阻液于室溫封阻10 min，棄去封阻液后用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min；傾去TBST，將體積分?jǐn)?shù)為0.01%的人抗腰果過(guò)敏原Ana o 3 蛋白的IgE單克隆抗體E- 2F5的TBST溶液(一抗)5 mL加入至離心管中，于4 ℃孵育12 h，孵育結(jié)束后棄去一抗，用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min；傾去TBST，將體積分?jǐn)?shù)為0.02%的生物素標(biāo)記羊抗人IgE的TBST溶液(二抗)12.5 mL加入至離心管中，于室溫孵育1 h，孵育結(jié)束后棄去二抗，用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min；用TBST按體積比為1∶60的比例稀釋HRP標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋液，傾去TBST，加入鏈霉親和素稀釋液10 mL于室溫孵育1 h，孵育結(jié)束后棄去鏈霉親和素稀釋液，用35 mL TBST洗膜3次，每次5 min。洗滌結(jié)束后，轉(zhuǎn)移NC膜至化學(xué)發(fā)光成像儀，加入ECL顯色液，成像并保存結(jié)果。

1.3.7腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的熱穩(wěn)定性測(cè)定

將分離純化所得的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白溶液用3 kDa超濾管濃縮并除鹽，用Braford法測(cè)定蛋白濃度，然后用磷酸鹽緩沖液(磷酸根濃度為0.02 mol/L，pH=6.8)配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蛋白溶液。取2 mL溶液裝在密封的耐高溫玻璃管中，置于160 ℃油浴中恒溫加熱10、15、20、25、30 min，加熱完成后置于冰水中冷卻備用。

采用圓二色光譜儀測(cè)定熱處理前后腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。樣品質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，比色皿為1 mm厚，波長(zhǎng)范圍為190～250 nm，速度為100 nm/min。

采用紫外分光光度計(jì)分析熱處理前后腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白空間結(jié)構(gòu)變化。將樣品蛋白溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，波長(zhǎng)掃描范圍為210～350 nm，掃描速率中等。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)并取平均值，圓二光譜數(shù)據(jù)用Dichroweb網(wǎng)站進(jìn)行分析，紫外和圓二光譜結(jié)果由Origin 2019軟件繪圖，并采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件的單因素方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，表格用Excel軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 腰果粗蛋白電泳分析結(jié)果

生腰果經(jīng)低溫粉碎、脫脂、浸提、冷凍干燥等操作后獲得的腰果粗蛋白凍干粉，而后進(jìn)行蛋白粗提物的Tricine- SDS- PAGE電泳分析，結(jié)果見圖1。研究表明2S白蛋白是低鹽濃度下的水溶性蛋白家族[7]，為減少其他蛋白的浸出，故采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行蛋白浸提。由圖1可知，腰果粗蛋白成分較為復(fù)雜，至少含11種蛋白成分，且大部分蛋白組分主要分布在10～80 kDa，粗蛋白中含量較高的蛋白條帶在10～15 kDa。此外，采用二次浸提方法可使原料利用率提高，且整個(gè)粗提過(guò)程始終處于低溫環(huán)境，可較大程度保留蛋白的天然活性。

圖1 腰果粗蛋白Tricine- SDS- PAGE電泳

2.2 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的分離純化結(jié)果

采用弱陰離子交換層析分離腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白純化峰型及電泳分析見圖2。腰果粗蛋白復(fù)溶后上樣，待未結(jié)合蛋白流出后，用0.1～0.3 mol/L NaCl洗脫液進(jìn)行連續(xù)的線性梯度洗脫，流速為2 mL/min。結(jié)果表明：根據(jù)圖2(a)和圖2(b)，峰2為NaCl洗脫后的第一個(gè)峰，其在NaCl濃度為0.12 mol/L時(shí)被洗脫下來(lái)，該峰收集組分經(jīng)Tricine- SDS- PAGE電泳和飛行時(shí)間質(zhì)譜(見圖3)檢測(cè)為腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白，其分子質(zhì)量約為12.6 kDa，與Reitsma等[8]純化的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白分子質(zhì)量相同。用Quantity One軟件對(duì)比圖2(c)條帶灰度值，發(fā)現(xiàn)該條帶的純度在98%以上。此外，通過(guò)圖2(a)可知，2號(hào)峰為洗脫后的第一個(gè)峰，且整個(gè)2號(hào)峰的洗脫過(guò)程約為15 min，說(shuō)明該純化方法簡(jiǎn)單高效。

圖2 純化腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白Tricine- SDS- PAGE電泳分析結(jié)果

圖3 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜

純化出的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的分子質(zhì)量為12.6 kDa，與Uniprot上的16.3 kDa存在一定質(zhì)量差異，主要原因是2S白蛋白是植物細(xì)胞液泡中經(jīng)蛋白水解后的小型球狀蛋白，其全長(zhǎng)前體蛋白通常被裂解成由2個(gè)二硫鍵連接的大亞基和小亞基，并經(jīng)翻譯后加工，信號(hào)肽、短連接子和側(cè)翼序列被切除，產(chǎn)生較小的成熟產(chǎn)物[15]。此類現(xiàn)象在巴西堅(jiān)果、芝麻、蓖麻等植物中也有同樣的體現(xiàn)，如巴西堅(jiān)果的前體蛋白為15 kDa，但從其浸提物得到的成熟2S白蛋白僅有13 kDa[16]。

2.3 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的得率分析

參考Reitsma等[8]的純化計(jì)算公式，對(duì)分離純化的得率進(jìn)行分析。生腰果中蛋白質(zhì)含量約為19%～21%[17-18]，腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白占腰果蛋白的5%[19]。由于粗蛋白浸提時(shí)無(wú)法完全浸提生腰果中的蛋白，且采用低鹽提取粗蛋白后各組分的比重發(fā)生改變，故以1 g生腰果所含腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白為基準(zhǔn)來(lái)計(jì)算腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的得率，陰離子法分離得到腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的含量及得率見表1。該陰離子交換法分離所得的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白得率為25.36%，相比于Reitsma等[8]純化得率的3%具有大幅度提升。這是由于2次提取和低鹽浸提法可盡量收集腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白，而Reitsma的方法中大部分的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白在樣品硫酸銨沉淀步驟中損失，從而導(dǎo)致較低的產(chǎn)率，由此可見在純化前的樣品處理中應(yīng)盡量提高目的蛋白的含量。

表1 陰離子法分離得到的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的得率

2.4 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

研究采用胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶解，然后使用LC- MS/MS對(duì)酶解后的樣品進(jìn)行鑒定，利用MASCOT等質(zhì)譜匹配軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，質(zhì)譜鑒定的總離子流圖見圖4，肽段序列比對(duì)結(jié)果見表2，主要特征肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖及肽段序列展示見圖5。

峰標(biāo)數(shù)值分別為出峰時(shí)間和分子離子峰質(zhì)荷比

表2 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白質(zhì)譜鑒定肽段序列鑒定

圖5 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白主要特征肽段的二級(jí)質(zhì)譜及肽段序列

結(jié)果表明：本研究純化所得蛋白與腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白相匹配，匹配度為60%。該蛋白在UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列號(hào)是Q8H2B8，分子質(zhì)量為16.3 kDa，匹配度為60%的原因也是腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白在成熟過(guò)程中會(huì)丟失信號(hào)肽、短連接子和側(cè)翼序列導(dǎo)致較小的成熟產(chǎn)物。結(jié)合Tricine- SDS- PAGE電泳鑒定目標(biāo)蛋白的結(jié)果，LC- MS/MS鑒定進(jìn)一步證實(shí)了陰離子法純化蛋白為腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白。

2.5 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的免疫印跡鑒定結(jié)果

對(duì)陰離子法純化所得的目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫印跡鑒定，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，與Tricine- SDS- PAGE電泳相對(duì)應(yīng)的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白組分的泳道在分子質(zhì)量約12.6 kDa處出現(xiàn)單一的條帶，說(shuō)明人抗腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的IgE單克隆抗體能夠特異性識(shí)別腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白，并且在其他分子質(zhì)量處無(wú)明顯的條帶，進(jìn)一步證明本研究純化出的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白純度較高。

圖6 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的Western Blotting分析

2.6 腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的熱穩(wěn)定性分析

2.6.1熱處理對(duì)Ana o 3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

利用圓二光譜分析熱處理前后腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見圖7和表3。由 圖7 可知，未經(jīng)熱處理的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白光譜曲線在220 nm、209 nm處呈負(fù)峰，在193 nm附近有一正峰，說(shuō)明未加熱腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)[20]。隨著腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白處理時(shí)間的升高，雙負(fù)峰的峰值發(fā)生了稍許的紅移，峰值明顯減小，α-螺旋有解旋趨勢(shì)。表明α-螺旋構(gòu)象比例下降，β-折疊構(gòu)象比例增加。

圖7 熱處理不同時(shí)間腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的 圓二色譜

從表3的數(shù)據(jù)可知，與未經(jīng)加熱的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白相比，160 ℃條件下不同時(shí)間的加熱會(huì)使腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的α-螺旋向其他二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。此外，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，α-螺旋含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量變化較小，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量稍有增加。與未加熱腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白相比，在加熱25 min時(shí)無(wú)規(guī)則卷曲含量下降，分子結(jié)構(gòu)更為有序，這可能是適當(dāng)熱處理可使天然腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白向更穩(wěn)定的形態(tài)轉(zhuǎn)化。160 ℃加熱可使腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但破壞程度較小，表明腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

表3 熱處理不同時(shí)間腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量

2.6.2熱處理對(duì)Ana o 3蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響

利用紫外光譜分析不同時(shí)間熱處理后腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的空間結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見圖8。天然腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的紫外光譜圖在280 nm附近有特征吸收峰，主要是由蛋白肽鏈上色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環(huán)π→π*躍遷引起的[21]。所有樣品的特征吸收峰均在280 nm附近，未發(fā)生藍(lán)移或紅移，說(shuō)明腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的色氨酸和酪氨酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)分布并未發(fā)生顯著變化。與未加熱樣品相比，加熱后特征吸收峰的吸光度升高,表明：加熱會(huì)使其變性，結(jié)構(gòu)展開，將更多的色氨酸和酪氨酸殘基暴露，空間結(jié)構(gòu)變得松散。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，特征吸收峰的吸光度整體趨勢(shì)逐漸升高，但加熱15 min的吸光度較未處理時(shí)有所下降，這可能是蛋白質(zhì)分子發(fā)生自聚集，芳香族氨基酸殘基的包埋所致[22]?？傮w而言，加熱可使腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白分子展開，空間結(jié)構(gòu)變得松散，芳香族氨基酸殘基暴露在分子表面，最終導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。

圖8 熱處理不同時(shí)間腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的紫外光譜

2.6.3熱處理對(duì)Ana o 3蛋白致敏性的影響

為明確不同時(shí)間熱處理后腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的致敏性變化，對(duì)熱處理前后的樣品進(jìn)行了電泳和免疫印跡分析，結(jié)果見圖9。從電泳圖可知，160 ℃加熱可導(dǎo)致腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白發(fā)生降解，并且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，降解程度也越高，這也印證了紫外結(jié)果中加熱會(huì)導(dǎo)致腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。通過(guò)免疫印跡發(fā)現(xiàn)160 ℃加熱后，腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白與商業(yè)化人抗腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的IgE單克隆抗體的免疫活性喪失，表明：熱處理后空間結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象型表位發(fā)生變化，且與商業(yè)化單抗結(jié)合的表位已被破壞[23]，但腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白降解的部分是否仍具有致敏性，需要結(jié)合腰果過(guò)敏原患者血清進(jìn)行進(jìn)一步的研究。結(jié)合電泳和免疫印跡結(jié)果表明：160 ℃的高溫加熱是降低腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白致敏性的潛在方法。

圖9 熱處理不同時(shí)間腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的致敏性變化

3 結(jié) 論

本研究得到了一種以新鮮生腰果為原料的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的純化方法，得到的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白的純度大于95%。腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白經(jīng)160 ℃加熱后，二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，但空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生較大破壞；此外熱處理后的腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白會(huì)發(fā)生降解，并且降解程度隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)而增高，部分表位被破壞。160 ℃ 熱處理可作為降低腰果過(guò)敏原Ana o 3蛋白致敏性的潛在方式，但在致敏性評(píng)價(jià)中使用的是單克隆抗體，后續(xù)研究中可使用腰果過(guò)敏患者血清進(jìn)行致敏性評(píng)價(jià)和進(jìn)一步表征過(guò)敏原表位。希望本研究可為腰果過(guò)敏研究提供原材料和相關(guān)低致敏性腰果蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供理論與技術(shù)參考。