郭麗娜，陳雙慶，王邦霞

（六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水 553004）

四川省自然資源科學(xué)研究院、蒼溪縣農(nóng)業(yè)局、蒼溪縣科委聯(lián)合選育的世界首個紅肉型獼猴桃新品種‘紅陽’屬中華系品種，因酸甜可口、營養(yǎng)價值高深受消費(fèi)者喜愛[1~3]。獼猴桃絕大多數(shù)品種為雌雄異株，主要依靠昆蟲授粉，同時也利用風(fēng)媒授粉。但花期不遇、雌雄比例不當(dāng)、惡劣天氣等容易導(dǎo)致授粉受精不良，而正常的授粉受精是獼猴桃雌株正常結(jié)果的前提條件和保證，是優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的基礎(chǔ)。目前僅僅依靠自然授粉并不能滿足優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的需要，人工輔助授粉就顯得尤為重要[4，5]。多年來，國內(nèi)外對獼猴桃授粉受精相關(guān)研究報道較多，從人工輔助授粉的采粉時期、花粉離體培養(yǎng)到花粉貯藏，都進(jìn)行了比較系統(tǒng)全面的研究[6~14]，但對于‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的研究多年來一直未見報道。鑒于此，本研究以‘紅陽’獼猴桃花粉為對象，探討其最佳生活力測定方法，以期為‘紅陽’獼猴桃花粉活力的檢測、花粉前處理及人工輔助授粉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

‘紅陽’獼猴桃花粉于2020年4月采自六盤水市米籮潤永恒獼猴桃公司獼猴桃基地。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

1.1.1 花粉生活力不同測定方法的比較試驗(yàn)

TTC染 色 法(Triphenyltetrazolium Chloride，TTC)設(shè)10個濃度TTC染色液，即0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%。參照李鵬[4]的方法。

I2-KI染色法(Iodine-iodidie Kalium，I2-KI)設(shè)3個濃度I2-KI染色液，即1.0%、2.0%、3.0%。參照楊紅等[15]的方法。

無機(jī)酸測定法(Mineral Acid，MA)設(shè)3個濃度硝酸溶液，即0.6、0.8、1.0 mol/L。參照劉葦[17]的方法。

離體萌發(fā)法(Germination in Vitro，GIV)培養(yǎng)液濃度配比參照李鵬[4]的最佳培養(yǎng)液組分，篩選最佳硼酸濃度和pH值。首先設(shè)置pH值6.5，硼酸濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L，25℃培養(yǎng)5 h，觀察花粉萌發(fā)情況；然后根據(jù)篩選出來的硼酸濃度，將‘紅陽’獼猴桃花粉置于不同pH值(4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的培養(yǎng)液中，25℃培養(yǎng)5 h，觀察花粉萌發(fā)情況。參照齊秀娟等[18]的方法進(jìn)行花粉活力檢測。

1.1.2 不同花粉生活力測定方法的比較試驗(yàn)

挑選與最佳離體萌發(fā)法檢測結(jié)果相近的TTC染色法、I2-KI染色法和無機(jī)酸測定法處理，進(jìn)行4種花粉生活力測定方法的比較研究，篩選出‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最佳測定方法。

1.2 數(shù)據(jù)分析

采用Spss19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過Excel 2010和Word 2010軟件完成圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色法

由圖1可知，TTC染色液濃度為0.5%時，‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最高，為72.43%，極顯著高于0.1%、0.2%、0.6%~1.0%三者處理(F=26.75，P＜0.01)，與0.3%、0.4%處理的差異不顯著；0.1%、0.2%、1.0%TTC染色液濃度處理的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最低，均在45%以下，0.9%處理的在50%以下，均極顯著低于其他所有處理，說明TTC染色液濃度過低、過高都不利于準(zhǔn)確檢測‘紅陽’獼猴桃花粉生活力。

圖1 不同濃度TTC染色液對‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的影響

2.2 I2-KI染色法

不同I2-KI染色液濃度下檢測的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力依次為86.00%、86.36%、85.87%，無顯著性差異(F=0.20，P＞0.05)，說明I2-KI染色液所選濃度均有利于準(zhǔn)確檢測‘紅陽’獼猴桃花粉生活力。在效果一致的情況下，宜選用濃度較低的，故I2-KI染色液濃度以1.0%~2.0%為宜。

2.3 無機(jī)酸測定法

由圖2可知，1.0 mol/L硝酸處理的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最高，為83.75%，極顯著高于0.6 mol/L與0.8 mol/L硝酸處理的(F=18.32，P＜0.01)，后二者間差異不顯著。

圖2 不同硝酸濃度對‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的影響

2.4 離體萌發(fā)法

‘紅陽’獼猴桃花粉生活力隨硼酸濃度的增加呈先升后降的趨勢(圖3)。硼酸濃度為0.15 g/L時‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最高，為78.00%，極顯著高于0.10、0.30 g/L硼酸處理的(F=5.60，P＜0.05)，但與0.20、0.25 g/L硼酸處理的差異不顯著。

圖3 不同硼酸濃度對‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的影響

‘紅陽’獼猴桃的花粉生活力隨pH值的升高呈先升后降的趨勢(圖4)。pH值6.5處理的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最高，為82.98%，與pH值7.0處理的(78.33%)差異不顯著，但極顯著高于其余處理的(F=183.37，P＜0.01)，說明檢測‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的最佳pH值為6.5~7.0。

圖4 不同pH值對‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的影響

2.5 不同花粉生活力測定方法的比較

與最佳離體萌發(fā)法檢測的結(jié)果相近的其他處理是:0.5%TTC染色液(TTC染色法)、1.0%~2.0% I2-KI染色液(I2-KI染色法)、1.0 mol/L硝酸(無機(jī)酸測定法)，將這3個處理檢測的花粉生活力與pH值6.5、pH值7.0處理的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)I2-KI染色法、無機(jī)酸測定法和離體萌發(fā)法(pH值6.5)檢測的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力無顯著差異，但均顯著高于離體萌發(fā)法(pH值7.0)檢測的結(jié)果(F=18.58，P＜0.01)；TTC染色法檢測的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力極顯著低于離體萌發(fā)法(pH值7.0)檢測的結(jié)果(表1)。說明1.0%~2.0% I2-KI染色液(I2-KI染色法)、1.0 mol/L硝酸(無機(jī)酸測定法)和離體萌發(fā)法(pH值6.5)均能快速準(zhǔn)確地測定‘紅陽’獼猴桃的花粉生活力；TTC染色法不適于‘紅陽’獼猴桃花粉生活力檢測。

表1 4種測定方法測定的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力比較%

3 結(jié)論與討論

3.1 不同花粉生活力測定方法的最佳處理

人工授粉前對‘紅陽’獼猴桃花粉生活力進(jìn)行準(zhǔn)確快速鑒定對其生產(chǎn)有著至關(guān)重要的意義?；ǚ凵盍﹁b定方法目前有TTC染色法、I2-KI染色法、無機(jī)酸測定法及離體萌發(fā)法。李鵬[4]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.5%TTC染色液處理的中華獼猴桃花粉生活力最高。胡春等[19]發(fā)現(xiàn)，鈍裂銀蓮花的花粉生活力隨TTC染色液濃度的增加呈先升后降的趨勢，TTC染色液濃度為0.5%時的花粉生活力最高。齊秀娟等[18]研究發(fā)現(xiàn)，美味獼猴桃花粉離體培養(yǎng)的適宜pH值為6.0~6.5。覃劍鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，花魔芋花粉離體萌發(fā)及花粉管伸長的最適pH值為6.5，大于6.5后花粉管長度逐漸降低。張露等[21]研究發(fā)現(xiàn)，礬根花粉離體萌發(fā)法的適宜pH值為5.0~6.5。本研究發(fā)現(xiàn)，TTC染色法測定‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的最佳濃度為0.5%TTC染色液，離體萌發(fā)法的最適pH值為6.5。與前人的研究結(jié)果基本一致。

不同植物花粉的I2-KI染色液及無機(jī)酸測定法最佳濃度不同。楊紅等[15]發(fā)現(xiàn)，I2-KI染色液濃度為1.0%時中華獼猴桃的花粉生活力最高。王士泉等[22]和涂清芳等[23]發(fā)現(xiàn)，I2-KI染色液濃度為2.0%時，四川牡丹和8個菊花品種的花粉生活力均最高。本研究發(fā)現(xiàn)，不同I2-KI染色液濃度下測得的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力無顯著性差異，均高達(dá)85%以上，與王士泉、涂清芳的研究結(jié)果一致，但與楊紅的研究結(jié)果不一致。劉葦?shù)萚17]研究發(fā)現(xiàn)，0.8 mol/L硝酸處理的圭亞那柱花草花粉生活力最高。賀慶梅等[24]通過比較柱花草花粉在不同硝酸濃度下生活力的高低發(fā)現(xiàn)，0.6 mol/L硝酸處理的柱花草花粉生活力平均達(dá)94.19%。王永周等[25]研究發(fā)現(xiàn)，無機(jī)酸法適用于臭椿花粉生活力的測定，硝酸濃度為0.8 mol/L時花粉生活力最高。本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mol/L硝酸處理的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力最高(83.75%)，這與劉葦、賀慶梅、王永周的研究不一致。究其原因可能與植物花粉本身的特性有關(guān)，也可能受培養(yǎng)溫度、時間等影響。

花粉萌發(fā)對授粉受精起著關(guān)鍵作用，不同植物花粉萌發(fā)時所需的硼酸濃度不同，適宜的濃度為0.05~0.15 g/L[26]。李鵬[4]與李平[27]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.15 g/L硼酸處理的中華獼猴桃和美味獼猴桃花粉生活力最高。本研究發(fā)現(xiàn)‘紅陽’獼猴桃花粉經(jīng)0.15 g/L硼酸處理后花粉生活力最高，與前人的研究結(jié)果基本一致。

3.2 不同花粉生活力測定方法的比較

本研究發(fā)現(xiàn)，利用離體萌發(fā)法測得的花粉活力高達(dá)80%以上。離體萌發(fā)法對于花粉培養(yǎng)條件要求高，且費(fèi)時，雖不能快速檢測花粉活力，但其檢測結(jié)果可作為標(biāo)準(zhǔn)，用來確定測定‘紅陽’獼猴桃花粉生活力的最佳方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，1.0%~2.0% I2-KI染色液(I2-KI染色法)、1.0 mol/L硝酸(無機(jī)酸測定法)和離體萌發(fā)法(pH值6.5)檢測的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力均在80%以上，說明I2-KI染色法和無機(jī)酸測定法均能快速準(zhǔn)確地測定‘紅陽’獼猴桃的花粉活力。李成忠等[28]認(rèn)為，TTC染色法因其對花粉質(zhì)量要求高，導(dǎo)致難以準(zhǔn)確測定花粉活力。李鵬[4]綜合比較TTC染色法和離體萌發(fā)法發(fā)現(xiàn)，離體萌發(fā)法更適合中華獼猴桃與美味獼猴桃花粉活力的測定。本研究發(fā)現(xiàn)TTC染色法測得的‘紅陽’獼猴桃花粉生活力極顯著低于離體萌發(fā)法的結(jié)果，這與李鵬的研究結(jié)果一致。說明TTC染色法不適于‘紅陽’獼猴桃花粉檢測。