鈕燕，白忠，吳海鶯，呂操，曹守明，馬燕，寧金梅

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，云南 昆明 650000；2.云南省曲靖市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000）

0 引言

對(duì)于真核生物核糖體而言，其組成分為兩大部分，分別為79種核糖體蛋白（ribosomal protein,RP）、4種 核 糖 體RNA（ribosomal RNA，rRNA）。有相關(guān)的研究指出，在核糖體形成，蛋白質(zhì)合成中，前者均扮演著重要的角色，且參與轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控、免疫細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等較多的生理與病理過程及變化[1]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些RP在眾多類型腫瘤中表達(dá)量升高，過表達(dá)的RP可能起到促進(jìn)腫瘤作用，某些RP在鼻咽癌組織中的表達(dá)異常，但就目前的相關(guān)研究來看，在鼻咽癌組織中，針對(duì)核糖體蛋白S15a（ribosomal protein S15a，RPS15a）的相關(guān)表達(dá)與功能研究文獻(xiàn)較少。故而筆者開展此次研究具有較高的意義，首先針對(duì)RPS15a在鼻咽癌組織中的表達(dá)展開了分析，并進(jìn)一步分析了RPS15a不同表達(dá)水平與此類疾病患者相關(guān)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

所有標(biāo)本來自昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016年10月至2019年12月因鼻咽部腫塊就診患者107例，對(duì)所有的患者標(biāo)本實(shí)施病理檢查，均確診低分化鱗癌（107例患者的相關(guān)標(biāo)本在取材前均未實(shí)施相關(guān)的治療，包括放化療）。隨機(jī)選取30例鼻咽部腫塊患者，取鼻咽部病變旁0.8-1cm的無腫瘤組織，對(duì)所取的組織實(shí)施病理診斷，均確診為癌旁正常組織，且均未經(jīng)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。需要注意的是，上述所提到的組織標(biāo)本保存待檢方法為：活檢后用氯化鈉溶液沖洗表面殘留血跡，置入冷凍管后，放入液氮罐或-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；而且均在活檢前對(duì)患者進(jìn)行告知，得到其同意后實(shí)施。昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)已經(jīng)對(duì)此次研究實(shí)施了相關(guān)審查，其結(jié)果顯示為通過。

1.2 主要試劑

兔抗RPS15a多克隆抗體由美國(guó)賽默飛世爾科技Invitrogen公司提供，工作濃度1:100。二甲苯、中性樹膠由國(guó)藥集團(tuán)提供，0.1%triton-100X由Sigma（上海）貿(mào)易有限公司提供，山羊血清由恒遠(yuǎn)生物公司提供，蘇木素由珠海貝索生物技術(shù)公司提供，0.25%鹽酸酒精、檸檬酸抗原修復(fù)液由邁新公司提供，EDTA 抗原修復(fù)液由碧云天公司提供，1xPBST 洗液為實(shí)驗(yàn)室自配，3%過氧化氫溶液、100%乙醇、75%乙醇實(shí)驗(yàn)室自有。

1.3 RPs15a表達(dá)的檢測(cè)

嚴(yán)格按照試劑盒說明書中的操作標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)流程、步驟等開展常規(guī)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)。首先，將烤箱設(shè)置為65℃、30min后，置入組織玻片進(jìn)行烘烤，取出后利用二甲苯缸進(jìn)行3次脫蠟處理，每次10min；利用酒精可以洗去二甲苯的作用，前后共4次置于酒精缸中，依次為100%酒精5min，100%酒精5min，100%酒精5min，75%酒精5min，流水沖洗5min；將經(jīng)過上述處理后的玻片置入檸檬酸鹽修復(fù)液缸中，再將缸放入高壓鍋內(nèi)，鍋內(nèi)加水至缸體2/3處，管壁高壓鍋270℃升溫煮沸至爆氣，將溫度調(diào)至180℃煮沸5min，關(guān)閉高壓鍋，保溫10min，開蓋取出玻片修復(fù)缸，室溫冷卻；將所得玻片置入1xPBS緩沖液中，浸泡時(shí)間設(shè)置為10min，根據(jù)組織大小，使用免疫組化筆畫出橢圓形的隔水圈后，再次利用1xPBST緩沖液進(jìn)行3次沖洗處理，每次時(shí)間均為5min，使用3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶5min，再次進(jìn)行沖洗5min處理，利用1xPBST緩沖液進(jìn)行，山羊血清封閉15min，染色，選擇使用1抗的濃度，1抗稀釋液使用0.1%triton，加入1抗置37℃孵箱1h，將1抗反應(yīng)結(jié)束的玻片使用1xPBST緩沖液清洗5min/3次，加入2抗，置37℃孵箱1h，將2抗反應(yīng)結(jié)束的玻片使用1xPBST緩沖液清洗5min，共3次，之后進(jìn)行避光染色處理，利用DAB染液，染色5min，此項(xiàng)操作結(jié)束后水洗終止染色，利用蘇木素進(jìn)行復(fù)染10s處理，流水沖洗之后，用0.25%鹽酸酒精分色2s，再次經(jīng)過流水沖洗之后，利用無水乙醇實(shí)施脫水處理，每缸2min，共計(jì)2缸，二甲苯缸浸泡，每缸2min，使用中性樹膠進(jìn)行封片。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，陰性對(duì)照品為4%免疫前羊血清。RPS15a表達(dá)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)組織中的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等進(jìn)行仔細(xì)觀察，如果出現(xiàn)清晰的黃色、棕黃色顆粒則判定為陽性。另外，針對(duì)每個(gè)組織標(biāo)本的染色情況進(jìn)行得分統(tǒng)計(jì)，方法為在鏡下觀察標(biāo)本的染色強(qiáng)度和廣度，以其乘積作為得分。其中在染色廣度中，分別記為0-4分，以陽性細(xì)胞占比作為計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，0-4分分別為陽性 細(xì)胞 占 比＜1%、2%-25%、26%-50%、51%-75%、＞75%；在染色強(qiáng)度中，以其著色情況作為計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，0-3分分別為無著色、黃色、棕色、深褐色。最終每個(gè)組織標(biāo)本的染色情況根據(jù)得分高低分為Ⅰ（0-1分）、Ⅱ（2-4分）、Ⅲ（5-8分）、Ⅳ級(jí)（9-12分），其中除Ⅰ級(jí)為陰性表達(dá)之外，Ⅱ級(jí)及以上均為陽性表達(dá)[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

此次利用軟件SPSS18.0，針對(duì)RPS15a表達(dá)水平、臨床相關(guān)的病例資料指標(biāo)等均實(shí)施[n（%）]與χ2檢驗(yàn)，在其對(duì)比過程中，如果對(duì)比結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則以P＜0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 RPs15a基因在鼻咽癌組織和癌旁組織的表達(dá)

見表1。

表1 RPs15a在鼻咽癌組織及癌旁組織的免疫組化表達(dá)

RPS15a 在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率為低表 達(dá)39.3%（42/107），高 表 達(dá)60.7%（65/107），在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為低表達(dá)100%（30/30），未有高表達(dá)的標(biāo)本，依據(jù)χ2檢驗(yàn)分析可知，與癌旁組織相比，在鼻咽癌組織中RPS15a基因的表達(dá)相對(duì)更高(P＜0.001)。RPS15a主要表達(dá)于鼻咽黏膜的腺體，多數(shù)位于細(xì)胞胞漿，少數(shù)位于細(xì)胞核及核膜（圖1、2）。

圖1 癌旁組織

圖2 鼻咽癌組織

2.2 RPs15a基因在鼻咽癌組織臨床病理資料的表達(dá)

見表2。

表2 鼻咽癌患者RPs15a表達(dá)與腫瘤特征的關(guān)系

將患者按年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、是否有復(fù)發(fā)情況、有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組進(jìn)行RPS15a表達(dá)陽性率比較，根據(jù)Mann-Whitney U分析可知，RPS15a基因的表達(dá)在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），與患者年齡、性別、 腫瘤大小、腫瘤分期、是否有復(fù)發(fā)情況無明顯相關(guān)性。

2.3 鼻咽癌患者RPs15a表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

見表3。

表3 鼻咽癌患者RPs15a表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

根據(jù)Spearman等級(jí)相關(guān)性分析可知，RPS15a基因的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，即隨著患者腫瘤惡性程度加深，RPS15a基因的表達(dá)隨之增加。

3 討論

鼻咽癌是一種起源于鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤[3]。雖然隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的進(jìn)步，該疾病的生存率顯著提高，但由于大部分的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于疾病晚期，甚至伴有不同程度的轉(zhuǎn)移等，故而其治療效果并不是十分理想。對(duì)此，筆者開展此次研究，旨在為鼻咽癌患者的早期臨床診斷以及預(yù)后評(píng)估尋找到更優(yōu)的生物標(biāo)志物。

對(duì)于核糖體蛋白而言，其除了主要參與蛋白質(zhì)的合成之外，還參與正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等[4]，因此其如果存在基因表達(dá)異常則可能會(huì)誘發(fā)疾病[5,6]。RPS15a是高保守的核糖體蛋白，其可在蛋白翻譯水平中介導(dǎo)腫瘤發(fā)生[7]，筆者考慮，這可能是導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生及進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制之一，而也有相關(guān)的研究指出，RPS15a可能在細(xì)胞中起著癌基因或癌基因激活劑的作用[8,9]。

在本研究中，在鼻咽癌組織中，RPS15a的陽性表達(dá)率更高，且其表達(dá)水平與患者的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。故而提示，RPS15a基因可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，具有較強(qiáng)的診斷與預(yù)后價(jià)值，有可能作為鼻咽癌治療的一個(gè)藥物靶點(diǎn)。