劉建明，曾安平

（西湖大學合成生物學與生物智造中心，浙江 杭州 310030）

面對日益嚴重的全球氣候災難，作為最主要溫室氣體，二氧化碳的減排和利用已經(jīng)迫在眉睫。據(jù)世界氣象組織報告，大氣中的二氧化碳濃度在過去半個世紀急劇上升，至2021年全球平均濃度已經(jīng)創(chuàng)下了近420 mL/m3的新高，隨之帶來全球氣候變暖和相應環(huán)境災害頻發(fā)［1］。為了全球應對這一巨大挑戰(zhàn)，中國在2020年聯(lián)合國大會上宣布實現(xiàn)“2030年前碳達峰，2060年前碳中和”的雙碳目標。要達成該目標需要迫切地發(fā)展綠色低碳經(jīng)濟體系（如能源轉(zhuǎn)型），大力減少二氧化碳的排放，同時需要開發(fā)高效經(jīng)濟的二氧化碳捕獲、封存和資源化利用技術(shù)。2022年5月，國家發(fā)改委印發(fā)《“十四五”生物經(jīng)濟發(fā)展規(guī)劃》，明確提出依托生物制造技術(shù)，向綠色低碳和可持續(xù)發(fā)展模式轉(zhuǎn)型。

二氧化碳高效生物利用是生物制造的重要發(fā)展方向［2-3］，其中包括生物體直接利用，如植物微生物固碳和構(gòu)建體外無細胞多酶分子機器固碳［4］。其中無細胞多酶催化體系，由于自己獨特的優(yōu)勢［包括背景清晰，擺脫細胞生長及內(nèi)部復雜的調(diào)控網(wǎng)絡；反應速度快，減少物質(zhì)跨膜運輸瓶頸；可操作性強，有助于聚焦對生物固碳途徑（包括人工設計組裝的全新二氧化碳固定途徑）本身的驗證和鑒定；易于挖掘高效的固碳元件等］，受到了廣泛的關注，研究成果層出不窮。2022年2月，James C.Liao教授團隊（原美國加利福尼亞大學洛杉磯分校）在Nature Catalysis上發(fā)表研究性論文“A cell-free self-replenishing CO2-fixing system”（Luo et al.，2022）［5］，人工設計和開發(fā)了新穎的多酶催化反應體系用于二氧化碳的固定和生物利用（圖1）。這一工作的最大特點在于成功組裝了對氧不敏感的固碳反應途徑，并嘗試建立了自動化的輔因子濃度監(jiān)測和調(diào)控方法，代表性地體現(xiàn)了多酶復合體系用于二氧化碳固定的理論前沿和現(xiàn)實挑戰(zhàn)。本文將基于設計和組裝體外多酶分子機器（包括結(jié)構(gòu)依賴性的關鍵酶的篩選和改造）、聚焦輔因子工程和其濃度智能監(jiān)控、從工程應用的角度分析二氧化碳利用的多酶分子機器開發(fā)所面臨的挑戰(zhàn)等3個角度簡要介紹這篇工作，并闡述作者自己的有關思考。

圖1 人工設計的二氧化碳固定多酶分子機器rGPS-MCG路徑和CETCH路徑（其中rGPS-MCG路徑由體外19個酶組成，需要NADPH、NADH、ATP、FAD和CoA等多種輔因子；而CETCH路徑由體外17個酶組成，需要NADPH、ATP、FAD和CoA等多種輔因子）TS—羥基丙二酸半醛；2PG—2-磷酸甘油酸；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸Fig.1 The artificial CO2-fixation pathways rGPS-MCG and CETCH cycle(The rGPS-MCG pathway consists of 19 enzymes and its function requires different cofactors,including NADPH,NADH,ATP,FAD and CoA;The CETCH cycle consists of 17 enzymes and it requires NADPH,ATP,FAD and CoA as cofactors.)TS—Tartronate semialdehyde;2PG—2-phospho-D-glycerate;PEP—phosphoenolpyruvate

1 設計和組裝多酶固碳分子機器

建立和組裝多酶復合反應一般要經(jīng)歷以下幾個步驟：①反應路徑的規(guī)劃和設計；②化學反應熱力學的可行性分析；③高效反應酶的挖掘、設計和改造；④反應路徑的組裝和優(yōu)化。Luo等首先基于建立“自循環(huán)更新反應”（self-replenishing）的理念，即固碳循環(huán)中的每個中間物都處于循環(huán)反應體系中，可以實現(xiàn)自我更新和供給，這樣一方面便于產(chǎn)品的多樣化（如C2、C3或C4等產(chǎn)品），另一方面是因為這樣的設計可以避免外源物質(zhì)的添加，靠中間物積累效應自發(fā)啟動化學反應進程（事實上所有的循環(huán)反應都具備這樣的特質(zhì)）。針對具體的固碳循環(huán)，作者選取了該課題組前期建立的逆糖醛酸循環(huán)途徑（reverse glyoxylate shunt，rGS）［6］和蘋果酰輔酶A-甘油酸循環(huán)途徑（malyl-CoA-glycerate carbon fixation，MCG）［7］，實現(xiàn)了丙酮酸間接固定二氧化碳產(chǎn)生乙酰輔酶A的凈固碳循環(huán)，巧妙繞開了丙酮酸通過脫羧反應生產(chǎn)乙酰輔酶A的傳統(tǒng)方式。隨后建立了新穎的還原型丙酮酸合成途徑（reductive pyruvate synthesis，rPS），作者首先對途徑中的每個酶反應進行了熱力學可行性分析，最終通過高效酶的篩選和模塊化組裝，實現(xiàn)了乙酰輔酶A間接固定二氧化碳到丙酮酸的閉合回路（圖1）。結(jié)合rGS和rPS途徑可以理論上實現(xiàn)2分子二氧化碳到1分子乙醛酸的合成反應，這一閉合循環(huán)反應稱為還原型乙醛酸-丙酮酸合成路徑（reductive glyoxylate-pyruvate synthesis cycle，rGPS）。rGPS和MCG路徑偶聯(lián)構(gòu)成了一個完整的閉合循環(huán)，滿足了所有中間產(chǎn)物的自我再生性能，實現(xiàn)了二氧化碳固定反應，奠定了多種C2、C3、C4或C5產(chǎn)品生產(chǎn)的理論可行性。

二氧化碳生物法固定通常有兩種方式：一種是二氧化碳直接固定，二氧化碳通過羧化酶與底物直接結(jié)合發(fā)生羧化反應，羧化酶的底物是二氧化碳或HCO-3；另一種是二氧化碳間接固定，指的是二氧化碳先被還原成甲酸、甲醇、CO或者乙酸等中間產(chǎn)物，然后通過其他酶將中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)品［8］。Luo等所構(gòu)建的rGPS途徑依賴于第1種方式，過程中選取了兩種羧化酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧 化 酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，Ppc）和巴豆酰輔酶A羧化酶（crotonyl-CoA carboxylase/reductase，Ccr）。因為羧化酶往往是決定固碳反應速率的一個關鍵因素，所以選擇合適的羧化酶對組裝高效的二氧化碳固定通路至關重要。以色列維茲曼科學研究所Ron Milo教授團隊［9］詳細比較了多種羧化酶的性能，包括酶反應速率、輔因子偏好和對氧氣的耐受性等（表1），為后續(xù)高效羧化酶的選擇奠定了基礎。從表1可以看出：Ppc和Ccr這兩種酶和其他的羧化酶相比，都具有較高的羧化效率，Ccr在飽和二氧化碳/HCO-3條件下，具有最高的比酶活速率130 μmol/(min·mg)。Ppc的比酶活速率也高達35 μmol/(min·mg)，作為對比，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶Rubisco的比酶活速率只有約3.5 μmol/（min·mg）。同時Ccr羧化酶也是德國馬克斯?普朗克研究所Tobias Erb教授組設計的巴豆酰輔酶A/乙基丙二酰輔酶A/羥基丁酰輔酶A（crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH）循環(huán)的關鍵羧化酶［10］。CETCH循環(huán)由不同來源的17個酶組成，它的固碳速率可以達到5 nmol/(min·mg)。Luo等建立的rGPS-MCG循環(huán)由19個酶組成，其中4步酶反應與CETCH循環(huán)重疊，但固碳速率有了明顯提高，最高時可達到28.5 nmol/(min·mg)（表2）。

表1 固碳途徑中關鍵酶-羧化酶性質(zhì)比較［5，9］Tab.1 Enzymatic properties of different carboxylases

另外值得注意的一點，rGPS-MCG和CETCH循環(huán)都由數(shù)十步反應組成，眾多的各生物元件在輔酶偏好性、催化活性、熱穩(wěn)定性、最適溫度和pH等方面都可能存在差異。各個元件性質(zhì)之間的差異將導致體外多酶分子機器反應系統(tǒng)適配性差，從而影響催化效率。因此在設計體外多酶分子機器時，反應路徑應該盡量減少所需酶元件的種類，并盡可能規(guī)避輔酶的使用，設計簡潔的固碳途徑有助于提高多酶分子機器各個元件之間的適配性和互容性。最近中國科學院微生物研究所李寅研究員團隊［11］基于另外兩個羧化酶——丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，Pyc）和丙酮酸：鐵氧還原蛋白還原酶（pyruvate：ferredoxin oxidoreductase,PFor），設計了僅含4步酶反應的固碳循環(huán)POAP（Pyc-Oxaloacetate acetylhydrolase-Acetate CoA ligase-PFor），實現(xiàn)了2分子碳到1分子草酸的合成，并且固碳效率達到了8 nmol/（min·mg）（表2）。但是POAP循環(huán)需要厭氧環(huán)境，而且循環(huán)需要消耗大量的輔因子——ATP、NADPH和鐵氧還原蛋白，限制了POAP循環(huán)的規(guī)模應用。

表2 體外人工合成固碳途徑性能比較Tab.2 Properties of in vitro carbon-fixation pathways

二氧化碳的間接固定則依賴于固定二氧化碳的衍生物，其中一個代表性的工作是中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所馬延和研究員團隊［12］構(gòu)建的人工淀粉合成途徑（the artificial starch anabolic pathway，ASAP），二氧化碳首先通過電催化轉(zhuǎn)變成甲醇或甲酸，然后通過后續(xù)的多酶（13個酶）級聯(lián)催化反應合成淀粉。最近的另外一篇代表性工作是二氧化碳到葡萄糖的合成，二氧化碳首先通過兩步級聯(lián)電催化反應轉(zhuǎn)變成CO，然后生成乙酸，乙酸再經(jīng)過酵母菌代謝工程改造合成葡萄糖［13］。這些創(chuàng)新性的工作都展示了二氧化碳的間接固定（如化學催化和酶催化級聯(lián)協(xié)同轉(zhuǎn)換的方式）的巨大應用前景，為未來開發(fā)出多元的、高效的固碳途徑提供了重要的參考。

2 聚焦輔因子工程

多酶體系生物合成的開發(fā)面臨著許多過程工程問題，諸如反應過程中輔因子的濃度監(jiān)測和調(diào)控，而這方面的工作很少。Luo等在輔因子濃度智能監(jiān)控方面進行了嘗試，建立了自動光學模塊用于實時監(jiān)測和控制輔因子濃度（圖2）。rGPS-MCG固碳路徑需要添加多種輔因子，包括ATP、NADH、NADPH、FAD和CoA。這些輔因子的濃度和平衡對反應至關重要。作者選用了肌酸激酶（creatine kinase）/肌酸（creatine phosphate）系統(tǒng)用于再生ATP，并通過建立熒光素酶方法，實時取樣監(jiān)測從而將ATP的濃度維持在0.6～0.8 mmol/L，因為過高的ATP濃度會對反應體系中的多種激酶有抑制作用。在反應體系中，NADH、NADPH的平衡和再生則分別是通過外源添加甲酸脫氫酶/甲酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶/葡萄糖-6-磷酸來維持的。作者通過實時檢測在340 nm的吸收波長維持反應體系中NADH和NADPH的濃度。至于FAD的再生，作者通過在反應中添加二茂鐵衍生物接受來自FADH2的電子用于FAD的再生，而二茂鐵/二茂鐵衍生物的循環(huán)，作者嘗試了兩種方案：一種是通過電化學方法再生，但是由于所使用的鉑電極可能吸附輔酶A及其衍生物，導致效果較差；另外一種方案是通過加入辣根過氧化物酶/雙氧水體系來實現(xiàn)的（圖2）。作者建立了基于300 nm吸收波長的二茂鐵衍生物濃度測定方法，用于控制體系中FAD濃度，進而嚴格控制雙氧水的添加（雙氧水和二茂鐵等物質(zhì)對其他酶有毒性）。CETCH途徑也需要多種輔因子的參與，如NADPH、ATP、CoA、維生素B12和O2等，其中NADPH和ATP的再生分別選取了不同的模塊——甲酸脫氫酶和多聚磷酸激酶/多聚磷酸。

圖2 輔因子濃度監(jiān)測和調(diào)控（rGPS-MCG路徑中輔因子ATP，NAD（P）H，F(xiàn)AD濃度的實時監(jiān)測。ATP調(diào)控模塊：肌酸激酶Cpk負責；NAD（P）H調(diào)控模塊：甲酸脫氫酶FDH或6磷酸葡萄糖酸脫氫酶G6PDH負責；FAD調(diào)控模塊：辣根過氧化物酶Hrp或電催化模塊負責）Fig.2 Cofactor monitoring and regulation(The cofactors in rGPS-MCG pathway,including ATP,NAD(P)H and FAD,are monitored.ATP regulation module,creatine phosphate kinase Cpk is responsible for ATP regeneration;NAD(P)H regulation module,formate dehydrogenase or glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PDH is responsible for NAD(P)H regeneration;FAD regulation module,horseradish peroxidase Hrp or electrochemical approach is used for FAD regeneration)

監(jiān)測和調(diào)控反應過程中輔因子的濃度是Luo等文章的一大亮點，也是rGPS-MCG路徑呈現(xiàn)出優(yōu)異的二氧化碳固定速率的關鍵因素，rGPS-MCG固碳路徑表現(xiàn)得比CETCH途徑優(yōu)越的一個重要方面可能是因為Luo等在反應中嚴格控制了多種輔因子的濃度，盡可能避免了高濃度的輔因子對多酶的抑制作用。維持輔因子濃度可以為多酶復合反應穩(wěn)定運行提供眾多優(yōu)點：①避免高濃度輔因子對酶元件的抑制作用，如高ATP濃度會抑制反應途徑中磷酸烯醇式丙酮酸合酶、蘋果酸硫激酶等酶活性；高雙氧水濃度會對乙酰輔酶A合酶等多酶有抑制作用。②避免低濃度輔因子影響酶元件的活性，如低雙氧水濃度會影響FAD的再生和抑制甲基琥珀酰-CoA脫氫酶的活性。③增加了多酶的穩(wěn)定性和延長了多酶復合反應時間。④為構(gòu)建魯棒性高的多酶分子機器提供了重要參考。

3 利用多酶分子機器固定二氧化碳所面臨的挑戰(zhàn)

多酶復合生物催化反應用于二氧化碳固定和高值利用，面臨著諸多的挑戰(zhàn)。

第1個挑戰(zhàn)是如何提高反應底物的供給。這里需要澄清的一個問題是途徑中所使用的真正底物是二氧化碳還是HCO-3？rGPS-MCG完整循環(huán)真正固定的是HCO-3。二氧化碳與HCO-3性質(zhì)完全不同，二氧化碳與空氣平衡時，在pH 7.4、20℃條件下在水中的溶解度僅為0.012 mmol/L，而HCO-3的濃度可以達到0.26 mmol/L［14-15］。二氧化碳的溶解度受pH影響較小，而HCO-3的溶解度受pH影響較大。高的底物濃度有助于提高化學反應動力學和酶轉(zhuǎn)換效率，因此使用碳酸氫鹽的碳固定效率在通常條件下比使用二氧化碳的固碳效率高。因此，開發(fā)高效的二氧化碳到HCO-3的轉(zhuǎn)換模式，比如使用具有高催化效率的碳酸酐酶（carbonic anhydrase），是固定和利用二氧化碳的前提。從途徑設計的角度考慮，如果羧化酶固定的是二氧化碳分子，因為其溶解度低等問題，則需要開發(fā)經(jīng)濟高效的碳捕捉和濃縮技術(shù)，包括設計人工羧化體（carboxysome）、碳酸氫鹽主動轉(zhuǎn)運蛋白等碳轉(zhuǎn)運機制［16］、優(yōu)化挖掘高效的二氧化碳固定酶和代謝路徑。

第2個挑戰(zhàn)是多酶復合體系的穩(wěn)定性、魯棒性和適配性。人工設計的rGPS-MCG路徑表現(xiàn)出一定的二氧化碳固定優(yōu)勢，但是整個反應體系面臨著很多的問題。首先，rGPS-MCG反應路徑魯棒性和穩(wěn)定性差，反應體系需要嚴格控制輔因子和多種反應底物的濃度，包括雙氧水、二茂鐵衍生物、甲酸等。而且，即使在自動監(jiān)測條件下，多種酶易失活和不穩(wěn)定，需要每隔半小時補充新鮮的酶制劑。因為反應路徑需要多種輔因子，所帶來的輔因子循環(huán)和平衡很難實現(xiàn)，大尺度條件下精準控制更是無從談起，比如添加雙氧水和過氧化物酶，如果攪拌達不到要求，會嚴重影響多種酶反應。真正利用無細胞多酶催化實現(xiàn)工業(yè)生物合成的例子鳳毛麟角，其中一個比較代表性的成功的工業(yè)案例是淀粉生產(chǎn)肌醇［17］。中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所張以恒研究員團隊構(gòu)建的體外合成途徑由熱穩(wěn)定性高的4種酶組成，分別為來源于超嗜熱古細菌的麥芽糖糊精磷酸化酶、磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)運酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，直鏈淀粉通過該四酶體系的“一鍋法”催化形成肌醇，而且反應體系中不需要外源添加ATP、NADH等輔因子。這一體外多酶復合體系的成功開發(fā)和商業(yè)化為后續(xù)開發(fā)固定二氧化碳的多酶體系提供了重要的借鑒：挖掘耐高溫的酶元件，提高酶的熱穩(wěn)定性和魯棒性，減少反應過程中輔因子的用量等。

關于適配性，目前無細胞多酶復合體系生物合成基本上都是“一鍋法”，普遍存在3個關鍵問題：①體系內(nèi)反應組分相互（反饋）抑制；②酶反應最優(yōu)條件不匹配；③間歇低效。解決上述問題急需開發(fā)新型生物合成體系，以克服體外多酶一鍋合成系統(tǒng)的局限。新型生物合成體系應具有如下特點：①根據(jù)不同酶的特點和要求實現(xiàn)反應區(qū)域化；②根據(jù)合成途徑的特點實現(xiàn)模塊化；③可控連續(xù)高效轉(zhuǎn)化。開發(fā)智能化多酶共固定、3D打印分子機器、產(chǎn)物原位分離技術(shù)等都是超越概念驗證（proof-of-concept）［或者說克服概念陷阱（proof-of-concept trap）］值得關注的方向。

第3個挑戰(zhàn)是如何利用綠能及人工光合作用進行基于二氧化碳的生物合成。二氧化碳化學性質(zhì)穩(wěn)定，這就意味著固定二氧化碳需要外部能量供給。從長遠角度看，利用可持續(xù)能源，如光能、電能和氫能提供能量固定二氧化碳才能發(fā)揮合成生物學和生物制造賦能“碳中和”的目標。植物光合作用是吸收太陽能進行光反應合成ATP和NAD（P）H，用于驅(qū)動暗反應卡爾文循環(huán)合成糖。人工光合作用的目標之一是將光能轉(zhuǎn)換成電能或氫能，然后通過電能或氫能驅(qū)動ATP和NAD（P）H的合成，或者通過電能活化二氧化碳分子轉(zhuǎn)變成甲酸、甲醇、甲醛等中間活性物質(zhì)，目前通過開發(fā)高效的催化劑，二氧化碳轉(zhuǎn)變成甲酸、甲醇的法拉第效率已經(jīng)超過或接近90%［18-19］，甲酸或甲醇可以作為良好的一碳生物原料用于生物制造［20］，為二氧化碳的間接利用提供了一個可行性的方案。

利用生物制造技術(shù)固定二氧化碳機遇和挑戰(zhàn)并存，James C.Liao教授團隊開發(fā)的rGPS-MCG新型多酶復合反應為構(gòu)建無細胞二氧化碳固定分子機器提供了重要參考，包括多酶組裝和輔因子調(diào)控等。未來篩選穩(wěn)定性和魯棒性高的酶元件，組裝多酶固碳體系和研究輔因子工程，開發(fā)綠能（太陽能，電能等）利用等策略會促進二氧化碳的高效利用，為真正解決碳中和問題提供方案。