董正鑫，孫韜，陳磊，張衛(wèi)文

（1天津大學化工學院合成微生物學實驗室，天津 300072；2天津大學生物安全戰(zhàn)略研究中心，天津 300072；3教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300072；4教育部合成生物學前沿科學中心，天津 300072；5化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

化石燃料仍是當前人類社會生活依賴的主要能源，每年由化石燃料所產生的CO2超過300億噸［1］，CO2的過度排放加劇了溫室效應，造成全球氣候變化，甚至威脅人類生存環(huán)境。此外，化石燃料為不可再生資源，其大規(guī)模消耗帶來潛在的能源危機，據(jù)估算全球化石燃料可能在50～100年后耗盡［2］。在能源與環(huán)境問題雙重壓力的背景下，開發(fā)清潔能源、改變能源結構迫在眉睫。我國政府于2020年第七十五屆聯(lián)合國大會提出，CO2排放量在2030年前達到峰值，爭取在2060年前實現(xiàn)碳中和。在隨后的2021年國務院政府工作報告，以及中央財經(jīng)委員會第九次會議中均制定了相關政策。要實現(xiàn)“碳達峰”和“碳中和”的目標，將大氣中的CO2重新轉化為燃料或化學品從而實現(xiàn)CO2資源化利用，無疑是一舉兩得的策略。2018年，中國科學院液態(tài)陽光課題組施春風教授等［2］提出利用太陽能、CO2和水生產綠色燃料的“液態(tài)陽光”策略，以太陽能為驅動實現(xiàn)CO2資源化利用，更為理想地解決能源問題與CO2排放問題。在較低營養(yǎng)條件下，光合藍細菌能夠在太陽能驅動下，以CO2和H2O為原料合成有機物。隨著合成生物學發(fā)展，已實現(xiàn)利用光合藍細菌作為生物底盤進行近百種燃料和化學品的綠色生物合成，也被認為是實現(xiàn)“液態(tài)陽光”的技術方案之一［3］。因此，基于光合藍細菌發(fā)展“液態(tài)陽光”技術，實現(xiàn)CO2的資源化利用，有助于解決能源問題與環(huán)境問題，助力“碳達峰”和“碳中和”的實現(xiàn)。

近年來，隨著科研人員的努力，以光合藍細菌為生物底盤已實現(xiàn)了近百種生物燃料和化學品的合成［4-6］。例如，在集胞藻PCC 6803中正丁醇在28 d產量達到4.8 g/L［7］，在聚球藻PCC 7002中烷烴產量達到了7.5 mg/g［8］，在聚球藻UTEX 2973中3-羥基丙酸產量達到68.29 mg/L［9］，聚羥基丁酸酯在集胞藻PCC 6803中能夠占細胞干重的81%［10］。這些生物燃料與化學品在光合藍細菌中成功生產，表明光合藍細菌作為“細胞工廠”進行高附加值化學品生產具有可行性，且在生物塑料生產方面具有天然優(yōu)勢。

盡管以光合藍細菌為底盤進行了近百種化學品的生產，但其工業(yè)化程度較低。其主要原因為光合藍細菌生長速度慢、生物量低和魯棒性差等。例如，集胞藻PCC 6803的倍增時間為4.3 h［11］，聚球藻PCC 7942的倍增時間為4.9 h［12］，而大腸桿菌的倍增時間為20 min［13］，釀酒酵母的倍增時間大約為90 min［14］。工業(yè)化過程中光合藍細菌在大規(guī)模培養(yǎng)過程中要面臨環(huán)境變化引起的高光、高溫、低溫、高鹽以及高堿等非生物脅迫［15-16］，限制其生長及最終生物量，同時在產品生產過程中，丁醇［17］、3-羥基丙酸［18］、乙醇［18］等產品的積累也會抑制其生長。光合藍細菌基因操作后不能脫除抗性標簽，限制了光合藍細菌基因改造的程度，難以實現(xiàn)菌株生產、生長以及耐受的同時優(yōu)化。因此，為了對光合藍細菌細胞工廠進行更深層次優(yōu)化，尋找新的解決方案勢在必行。

調控工程（regulatory engineering）基于天然調控系統(tǒng)，通過對天然調控系統(tǒng)元件進行設計，實現(xiàn)對調控系統(tǒng)的信號感知、信號轉導或調控因子作用過程的干預，完成對多基因表達水平的調控，最終實現(xiàn)對全局代謝網(wǎng)絡的調控。在大腸桿菌生產靛藍的研究中，Chen等［19］采取共培養(yǎng)的生產方式，將靛藍合成前體物質色氨酸的生產優(yōu)化與靛藍合成途徑優(yōu)化分別在兩個菌株中進行，其中色氨酸生產途徑優(yōu)化包含5個基因的過表達，靛藍合成途徑包含1個基因的過表達，最終產量達到55.4 mg/L。由此可見，微生物中高附加值產品的生產往往需要對整體代謝網(wǎng)絡進行重新調整，這一復雜過程的實現(xiàn)需要同時對多個基因的表達水平進行調控，而通過對相關基因進行逐一調控費時費力，效率不高，為平衡菌株生長與產品產量需將前提供應與生產在兩株菌中進行。在上述研究基礎上，Chen等［19］對靛藍生產菌株中編碼RNA聚合酶的α亞基的基因rpoA進行隨機突變、篩選，靛藍產量達到了80.6 mg/L。此外，基于調控工程實現(xiàn)菌株對代謝網(wǎng)絡進行自適應調控是實現(xiàn)智能化細胞工廠的關鍵，Jia等［20］在大腸桿菌中使用RNA溫度響應開關與群感系統(tǒng)結合組成的基因線路，控制不同溫度下表達不同的熱耐受基因的表達，實現(xiàn)了大腸桿菌的梯度耐熱。Bao等［21］用群感系統(tǒng)控制調控RNA，將生長過程與生產過程分離，低密度菌體時不對生產途徑的競爭途徑進行抑制，保證底盤的快速生長，當菌體密度達到閾值后，群感系統(tǒng)控制調控RNA開始表達，對產品生產的競爭途徑進行抑制，在大腸桿菌生產松萜的應用中，松萜產量提高了365.3%。在異養(yǎng)微生物中對調控系統(tǒng)的研究充分說明了調控工程的應用潛力，在光合藍細菌中有望通過調控工程取得更大研究進展。

目前，在藍細菌中基于合成生物學方法進行化學品生產以及底盤魯棒性提高的相關報道已有許多［5，17，22］，在取得進展的同時也面臨著很多挑戰(zhàn)。以光合藍細菌中異丁醇生產為例。在聚球藻PCC 7942中，Li等［23］將糖原合成關鍵基因glgC進行敲除后，使更多碳源流向異丁醇合成途徑，在50 mmol/L NaHCO3的條件下異丁醇產量達到了550 mg/L。為進一步提高聚球藻PCC7942中異丁醇的產量，Wu等［24］在2% NaCl培養(yǎng)條件下培養(yǎng)工程菌株，在鹽脅迫條件下促進了工程菌株脂質降解，增加了異丁醇合成所需的NADH，并增加了膜通透性，有助于異丁醇排出，降低異丁醇毒性，最終異丁醇產量達到637 mg/L。在加鹽培養(yǎng)環(huán)境下，光合藍細菌底盤整體代謝模式和膜特性的改變有益于異丁醇的生產，表明了光合藍細菌在全局水平調控有進一步提高異丁醇產量的優(yōu)化空間。值得注意的是，加鹽培養(yǎng)條件盡管提高了異丁醇產量，但同時抑制了菌株生長，異丁醇產量的提高，也會對細胞產生毒性。從全局代謝調控的水平上對響應鹽信號后對異丁醇生產有益的模塊給予一個模擬鹽信號刺激，而不利于生長以及生產的鹽響應模塊不能接受該模擬信號，同時加強異丁醇耐受調控模塊，提高底盤對異丁醇的耐受性，從而進一步提高異丁醇產量是一個較為理想的狀態(tài)。因此，發(fā)展調控工程實現(xiàn)對全局代謝網(wǎng)絡的精準調控對藍細菌細胞工廠的發(fā)展很有必要。

為了應對環(huán)境脅迫，細胞會通過整體代謝網(wǎng)絡的改變來實現(xiàn)對于代謝的精準調控。細胞接收刺激信號后會通過胞內的調控系統(tǒng)進行一系列復雜過程對相關基因進行差異性表達，如圖1所示。細胞對環(huán)境適應過程往往是多基因差異性表達的結果。例如，在單一鹽脅迫條件下，集胞藻PCC 6803約有100個基因參與到這一調控過程［25］。鑒于調控系統(tǒng)的精準性和廣泛性，調控工程有望實現(xiàn)基因的多層次調控以及代謝流重新分配，進一步提高藍細菌生產能力。近年來，圍繞光合藍細菌調控工程在非生物脅迫以及代謝調控方面的研究取得諸多進展。為此，本文對藍細菌中調控工程應用與前景進行闡述，對藍細菌底盤構建的挑戰(zhàn)進行了總結和分析，以期促進魯棒性藍細菌底盤的構建及其未來的規(guī)?；瘧?。

圖1 藍細菌調控系統(tǒng)Fig.1 Cyanobacterial regulatory systems

1 藍細菌中代表性的調控系統(tǒng)

藍細菌在自然界中分布廣泛，包括海洋、陸地和河流等，能夠適應不同的環(huán)境以維持生存［26］。為維持細胞穩(wěn)態(tài)，處于不同環(huán)境下的藍細菌必須能夠接收外界環(huán)境條件變化的信號，并通過調控系統(tǒng)完成靶基因差異性表達，實現(xiàn)細胞代謝模式的精準改變。藍細菌中能夠在不同環(huán)境下實現(xiàn)全局代謝模式精準改變的調控系統(tǒng)引起了人們的廣泛興趣。目前，藍細菌中廣泛研究的調控系統(tǒng)主要包括雙組分信號轉導系統(tǒng)（two-component systems，TCS）、σ因子和sRNA調控系統(tǒng)，在適應環(huán)境脅迫過程中扮演重要角色［27-29］。

1.1 TCS在環(huán)境適應中的作用

雙組分調控系統(tǒng)在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、噬菌體、酵母、植物以及低等動物中均有發(fā)現(xiàn)，但在細菌中最為常見，尤其是在革蘭氏陰性菌中［30］。經(jīng)典的TCS主要包括負責感知并轉導信號的組氨酸激酶（histidine kinases，Hik）與接收信號并改變胞內生理機能的響應調控蛋白（response regulators，Rre）兩部分。TCS信號轉導過程如圖2所示，Hik接受環(huán)境刺激后，以三磷酸腺苷（ATP）為底物，將磷酸基團轉移到組氨酸殘基，進行自磷酸化，形成高能量磷酸基團，隨后磷酸基團轉移到Rre的天冬氨酸殘基。Rre構型發(fā)生改變后，結合到調控基因的啟動子區(qū)域，完成信號轉導與調控基因差異表達［31］。目前，在多種微生物體內發(fā)現(xiàn)了TCS以及不同TCS的響應條件，例如酵母熱休克響應機制［32］、大腸桿菌酸適應機制［33］、谷氨酸棒狀桿菌缺氧調節(jié)機制［34］等。

圖2 TCS信號轉導過程Fig.2 TCS signal transduction process

光 合 藍 細 菌 中TCS的 研 究 在Kaneko等［35］1996年完成集胞藻PCC 6803的全基因組測序后，得以快速發(fā)展。在聚球藻PCC 6301中鑒定出37個與TCS相關的基因，而這株菌與模式菌株聚球藻PCC 7942基因組非常相似［36］?；蚪M分析后預測，在集胞藻PCC 6803中至少有90個基因與TCS有關［37］，但目前大部分TCS基因的調控功能尚不明確。集胞藻PCC 6803全基因組測序的完成和TCS相關基因的預測讓TCS突變體庫的構建成為可能。作者課題組通過在集胞藻PCC 6803中構建了44個Rre缺失突變庫，鑒定出與丁醇耐受相關的響應調控蛋白Slr1037［38］和與酸耐受相關的響應調控蛋白Slr1909［39］，并對Rre缺失突變的中心碳代謝以及能量代謝進行分析［40-41］。隨著藍細菌中TCS研究工作的開展，其調控機制與靶基因被解析清楚［27］，揭示了TCS在調控網(wǎng)絡中的重要地位，為在藍細菌中使用TCS工程，實現(xiàn)精確的代謝網(wǎng)絡調控提供了理論支持和參考依據(jù)。

1.2 σ因子的分類及其調控過程

σ因子是原核生物體內一類調控蛋白，參與RNA聚合酶（RNAP）全酶的形成［42］。σ因子調控過程如圖3所示，RNAP核心酶復合體與σ因子結合后形成全酶，在σ因子的引導下，RNAP錨定到特定基因的啟動子區(qū)域，啟動基因轉錄。啟動特定基因表達的σ因子并非是特定的，取決于啟動該基因表達的環(huán)境信號。在不同環(huán)境下，激活不同的基因表達模式，維持細胞穩(wěn)態(tài)，以應對環(huán)境變化。

RNAP的核心酶由6個單獨的亞基構成［43］，如圖3所示。RNAP的核心酶與σ因子結合形成RNAP，進而具備激活靶基因轉錄的功能。大腸桿菌中σ因子主要分為RpoD（σ70）與RpoN（σ54），而藍細菌中沒有發(fā)現(xiàn)與RpoN（σ54）具有相似結構的蛋白［44］，僅存在RpoD（σ70）家族的σ因子。依據(jù)結構差異σ70家族主要分為4個亞家族。第1組σ因子稱為初級σ因子，分為4個結構部分：σ1、σ2、σ3、σ4，在細菌中廣泛存在，負責組成型基因的轉錄，這些基因在細胞生長過程中具有重要作用［45］。第2～4組σ因子稱為選擇性σ因子，具有特定的功能。初始狀態(tài)抗σ因子與選擇性σ因子結合，抑制選擇性σ因子發(fā)揮作用，在接收到環(huán)境變化信號后，選擇性σ因子被釋放，與RNAP結合激活靶基因轉錄［46］。這類σ因子如同分子開關，能夠引導RNAP開啟或關閉一類基因的轉錄。第2組σ因子與第1組σ因子在結構上相差最小，僅缺少σ1.1區(qū)域，大部分的選擇性σ因子屬于第2組，能夠與第1組σ因子競爭調控某些基因的表達［47］。第3組σ因子主要調控初級σ因子不參與調控的基因，在結構上與第1組σ因子相比缺少了σ1區(qū)域。第4組σ因子稱為胞質外作用σ因子，負責感應胞質外環(huán)境變化，能與第1組σ因子在調控基因上產生競爭，在結構上與第1組σ因子相比缺少了σ1與σ3區(qū)域［48］。

圖3 σ因子調控過程Fig.3 Sigma factor regulation process

σ因子作為一種脅迫響應元件，在面臨環(huán)境脅迫時，能夠調控代謝途徑，以應對環(huán)境變化。因此，在以光合藍細菌為底盤進行產品生產的調控中，使用σ因子工程調控靶基因的轉錄具有可行性。目前，多種σ因子在藍細菌中的調控作用已被報道，例如SigB能夠響應熱刺激、鹽脅迫以及溫度等環(huán)境變化［49-50］，SigC與熱適應相關［51］，SigD與SigE能夠響應光誘導［50］，SigF與鹽脅迫適應以及分泌系統(tǒng)相關，缺失SigF的菌株在鹽脅迫條件下出現(xiàn)嚴重缺陷［52-53］。在聚球藻PCC 7942中，4個σ因 子（RpoD2、RpoD6、RpoD5和SigF2）在RpaA的調控下調控生物鐘［54］，σ因子SinA與聚球藻的熱適應相關［55］。隨著藍細菌中σ因子研究的進行，其調控過程和靶基因相繼得到解析，有助于對藍細菌σ因子調控網(wǎng)絡的理解，為藍細菌中σ因子調控工程提供參考。

1.3 sRNA的分類及其調控過程

生物體內除常見的mRNA、tRNA、rRNA外還存在具有調控功能的非編碼RNA，在原核生物體內這些具有調控功能的非編碼RNA長度通常為50～500個核苷酸［29］，一般將長度大于200個核苷酸的非編碼RNA稱為長鏈非編碼RNA［56］，這些具有調控功能的調控RNA統(tǒng)稱為sRNA。其調控過程如圖4所示。sRNA通常不具有開放讀碼框，不編碼蛋白質，部分sRNA可直接與DNA結合，抑制轉錄過程，大多數(shù)情況下通過完全或不完全的堿基互補配對識別并結合到目標mRNA，具有抑制翻譯過程或維持mRNA穩(wěn)定的作用，參與到基因的轉錄后調控階段［57］。sRNA參與調節(jié)的另一種形式是與蛋白結合改變蛋白結構從而調控蛋白的催化活性［58］。sRNA在藍細菌調控網(wǎng)絡中占據(jù)非常重要的地位，在集胞藻PCC 6803中，通過對轉錄組進行分析，推測sRNA調控了集胞藻PCC 6803中10%的基因［59］。sRNA參與光合藍細菌在多種環(huán)境下的響應調控，例如CoaR參與丁醇脅迫條件下的調控［60］，RblR參與光合作用過程調控［61］，Nc117參與短鏈醇耐受調控過程［62］等。

圖4 sRNA調控過程Fig.4 sRNA-mediated regulatory process

在集胞藻PCC 6803、聚球藻PCC 7942和聚球藻UTEX 2973中，通過比較分析發(fā)現(xiàn)諸多潛在調控RNA位點［63-64］，為后續(xù)sRNA的研究提供了研究方向。sRNA參與了藍細菌在多種環(huán)境下調控過程，在鹽、堿、熱、低營養(yǎng)等環(huán)境刺激下，轉錄組具有明顯差異，其中的潛在sRNA也發(fā)現(xiàn)具有明顯不同［65-66］，揭示了sRNA在藍細菌適應環(huán)境變化中具有重要作用。sRNA在不同環(huán)境條件下的表達模式也受到整個調控網(wǎng)絡的控制，在同一環(huán)境條件下，存在多種調控方式的共同作用，通過其他形式調控sRNA的表達量來進一步調控效應蛋白的表達［67］。

2 藍細菌的調控工程

以藍細菌為底盤進行各種化學品的生產近年來已取得較大進展，但藍細菌的大規(guī)模培養(yǎng)以及產率問題嚴重制約著工業(yè)化進程。為進一步提高藍細菌底盤的魯棒性以及產品產率，一方面要尋找性能更為優(yōu)異的藍細菌底盤［68-69］，而另一方面要對藍細菌代謝網(wǎng)絡進行優(yōu)化。局部代謝調控在藍細菌代謝工程中已取得顯著成果，為進一步提高藍細菌底盤魯棒性優(yōu)化代謝網(wǎng)絡，以藍細菌調控系統(tǒng)為著手點，進行藍細菌全局范圍內的代謝調控是進一步提高藍細菌耐受性以及產品產率的重要方法［70-73］。

2.1 TCS工程在藍細菌中的研究與應用

TCS作為細胞內具有感知外部環(huán)境變化以及信號轉導功能的系統(tǒng)，調控代謝網(wǎng)絡以適應環(huán)境變化方面的重要性毋庸置疑。目前，在藍細菌中已對多種TCS在不同環(huán)境下的功能進行了鑒定，其中部分TCS已作為工程方法在藍細菌中進行了應用。

2.1.1 TCS工程在金屬離子調控中的作用

藍細菌正常生理活動需要一定量金屬離子的參與，但過量的金屬離子會對細胞產生毒性。例如，銅離子具有維持細胞色素氧化酶和質體藍素的正常功能的作用，在集胞藻PCC 6803中，Hik31-Rre34具有監(jiān)測胞內銅離子濃度、調控銅離子轉運蛋白的功能。Hik31能夠特異性響應銅離子并與銅離子結合，監(jiān)測胞內銅離子濃度，胞內銅離子濃度升高后，Hik31將信號轉導至Rre34，Rre34結合到銅離子轉運蛋白copBAC的啟動子區(qū)域，提高CopBAC的表達量，進而降低胞內銅離子濃度［74］。copM與Hik31-Rre34在同一操縱子，具有結合一價銅離子與二價銅離子的能力，在Rre34缺失突變體內過表達CopM能夠緩解銅離子敏感表型同時胞內銅離子濃度恢復到正常水平［75］，而Rre34能夠結合CopM-Hik31-Rre34操縱子啟動子區(qū)域，調控該操縱子的表達［74］。

因工業(yè)生產過程中鎘的使用，鎘離子在環(huán)境中廣泛存在，且比銅離子毒性更強。Sll0649是集胞藻PCC 6803中的一個響應調控蛋白，參與鎘離子耐受調控過程，同時與胞內Cu2+、Cd2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等多種二價金屬離子穩(wěn)態(tài)相關，能夠結合到sll1598和slr0798（分別編碼Mn2+和Cu2+轉運蛋白）的上游區(qū)域，敲除sll0649基因后，菌株會對上述金屬離子更加敏感［76］。因此，Sll0649在維持集胞藻PCC 6803胞內二價金屬離子穩(wěn)態(tài)方面扮演重要角色，為TCS工程調控藍細菌胞內二價金屬離子穩(wěn)態(tài)提供了方向。

2.1.2 TCS工程在抗紫外輻射調節(jié)中的作用

太陽光中的紫外光（UV），尤其是其中的UV-B輻射（280～320 nm），對藍細菌的生存提出挑戰(zhàn)。類菌胞素氨基酸（MAA）具有吸收UV-B輻射、保護細胞的作用［77］，在藍細菌受到UV-B輻射時能夠在胞內積累且有助于細胞脫水后恢復。在Nostoc flagelliformeCCNUN1中，對參與到紫外輻射信號轉導過程的LuxR家族的Rre OrrA進行過表達后，提高了MAA合成相關基因的表達量，菌株的UVB輻射耐受性與脫水后恢復能力增加［78］。該研究在Nostoc flagelliformeCCNUN1中鑒定出了由mysC1、mysC2、mysA、mysB和mysD組成的MAA生物合成基因簇，并證明MAA的生物合成響應UV-B輻射，且響應過程受到Rre OrrA調控，進一步確定了Rre OrrA能夠作用到MAA合成基因的啟動子位置。MAAs類物質在提高藍細菌抗干旱以及耐輻射能力方面具有極大潛力，同時可以作為具有高附加值的防曬霜有效成分進行生產［79］。

2.1.3 TCS工程調控藍細菌丁醇耐受

TCS工程能夠提高藍細菌底盤對毒性產品的耐受性。在藍細菌進行丁醇生產的過程中，丁醇作為產物對藍細菌生產具有毒性，限制藍細菌的生長，進一步限制了其產量的進一步提高，如何提高藍細菌對丁醇的耐受性成為提高丁醇產量的關鍵。

在集胞藻PCC 6803中通過對Rre缺失突變庫進行篩選，篩選出Slr1037與Sll0039缺失突變體對丁醇更為敏感［38，80］。在集胞藻PCC 6803中，對編碼響應調控蛋白的slr1037和sll0039基因分別進行過表達，突變菌株對丁醇耐受性均有所提高，當這兩個基因同時過表達時，丁醇耐受性較野生型提高133%［37］。值得注意的是，在集胞藻PCC 6803中丁醇耐受性不僅受到Rre Slr1037與Sll0039的調控，還受到sRNA CoaR的調控［60］，其中CoaR對丁醇耐受有負調控效果，在slr1037的缺失突變體中抑制CoaR的產生能夠恢復丁醇耐受性，通過蛋白組學比較發(fā)現(xiàn)Rre Slr1037與sRNA CoaR存在潛在的共同調控靶點［67］。由此可見，藍細菌對丁醇耐受性的調控是一個復雜過程，包含了至少兩種調控方式，且兩種調控過程存在串擾。

2.1.4 TCS工程調控藍細菌鹽耐受以及碳代謝

鹽脅迫的改善對藍細菌使用海水進行大規(guī)模養(yǎng)殖具有非常重要的意義［22］，同時鹽脅迫條件下的代謝模式有利于一些產品例如蔗糖、甘油葡萄糖苷（GG）的生產［24］，而鹽脅迫下調控系統(tǒng)及其代謝模式的研究有助于調控工程在藍細菌中的使用。在集胞藻PCC 6803鹽脅迫條件下TCS的研究中，通過對Hik缺失突變體庫進行篩選，發(fā)現(xiàn)了Hik33、Hik34、Hik16和Hik41能夠感知鹽脅迫環(huán)境，控制了集胞藻PCC 6803中20%與鹽誘導基因的表達，其中Hik33感知鈉離子而Hik16與Hik41僅感知NaCl［81］。Hik34在感知鹽脅迫條件后能夠將信號傳遞給Rre1，進一步調控乙醇脫氫酶AdhA的表達［82］。此外通過對潛在絲氨酸/蘇氨酸激酶突變體庫篩選后，發(fā)現(xiàn)SpkG也具有感知鹽脅迫的功能［83］。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下Hik2與Hik34共同調控Rre1［84］，而Hik2感受器受Na+的嚴格誘導［85］。鹽脅迫條件下細胞容易發(fā)生聚團現(xiàn)象，形成生物膜抵抗外界環(huán)境影響，在集胞藻PCC 6803中Hik36-Hik43和Rre6組成的雙組分系統(tǒng)能夠感知外部環(huán)境變化后提高胞外多糖以及抑制與菌毛形成相關蛋白PilT2的合成，促進生物膜的形成［86］。

在聚球藻PCC 7942中Synpcc7942_1125與Synpcc7942_1404基因缺失突變體能夠增加鹽耐受性，增加菌株內糖原的積累量，降低光損傷。有趣的是，Synpcc7942_1125與Synpcc7942_1404不調控蔗糖（可作為滲透保護劑）合成基因的表達，且雙突變體不能進一步增加單突變體的效果［87］。在魚腥藻PCC 7120中，Rre OrrA能接收鹽脅迫信號，促進蔗糖的積累以維持滲透壓的平衡，過表達Rre OrrA后提高了蔗糖的積累量［88］。同時，OrrA促進σ因子SigB2的產生，而SigB2進而促進蔗糖的積累。SigB2缺失突變體在鹽脅迫初期，蔗糖積累延遲，證明其在鹽脅迫響應初期具有重要作用［88］。由此可見，在不同脅迫時間段，應采用不同的調控策略以保證菌株的生存。此外，OrrA在干旱條件下同樣具有信號轉導調控基因表達的作用［89］，表明其具有增加底盤多元抗逆的潛力。

目前，通過TCS工程方法，調節(jié)細胞代謝網(wǎng)絡，優(yōu)化產品產量已在藍細菌中進行了初步應用。在集胞藻PCC 6803中，Rre37參與氮缺乏條件下的代謝調控，單獨過表達Rre37能夠改變參與三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝相關基因的表達［90］。最近報道，將Rre37與SigE在集胞藻PCC 6803中同時進行過表達能夠提高琥珀酸產量，在黑暗厭氧條件下琥珀酸產量達到420 mg/L［91］，為琥珀酸生產提供了一個良好的底盤。

2.2 σ因子工程在藍細菌中的研究與應用

第1組σ因子與第2組σ因子在結構上非常相似，主要負責調控胞內組成型啟動子控制的基因的表達，這些基因通常是細菌正常代謝所需的。在藍細菌中，第2組σ因子往往參與到環(huán)境變化信號響應調控過程，如營養(yǎng)、光和溫度等［27］。

2.2.1 σ因子工程在藍細菌抵抗非生物脅迫中的作用

在集胞藻PCC 6803中，構建第2組σ因子的4種三重敲除菌株（ΔsigCDE、ΔsigBDE、ΔsigBCE、ΔsigBCD），在不同光照條件及鹽脅迫條件下進行生長表型的測定，4種突變體在低光條件下生長速度降低，推測這4種σ因子可能參與了光適應調節(jié)模塊。有趣的是，僅有SigB存在的突變體在鹽耐受表型上較野生菌株有小幅度提高，說明SigB在鹽適應過程中具有非常重要的作用［92］。在魚腥藻PCC 7120中存在屬于第2組σ因子的SigB2也能夠響應鹽脅迫信號，并參與滲透相容性溶質蔗糖的代謝調控，促進鹽脅迫條件下蔗糖的積累［88］。更為有趣的是，在集胞藻PCC 6803中SigB還具有增加其他脅迫條件下菌株適應性的能力，僅過表達SigB顯著提高了菌株熱耐受與丁醇耐受，將46℃條件下細胞CFU（colony-forming units）值提高了20倍，在2.5%丁醇中處理1 h的條件下過表達SigB的突變株存活率提高了15倍［93］。

此外σ因子在藍細菌適應氧化脅迫條件中均發(fā)揮著重要作用。在集胞藻PCC 6803中，第2組σ因子均參與氧化應激過程調控，其中SigB和SigD起主要作用，而SigC和SigE起次要作用，ΔsigBCE菌株在單線氧、高光誘導氧化脅迫和H2O2氧化脅迫條件下的生長優(yōu)于對照，而ΔsigCDE菌株在H2O2氧化脅迫條件也較對照菌株也體現(xiàn)出生長優(yōu)勢，其主要原因是僅有一個第2組σ因子存在時，其表達量有所提高［51］。

2.2.2 σ因子工程調控藍細菌的中心碳代謝

σ因子作為代謝調控工具已經(jīng)在藍細菌中有了初步應用。SigE在集胞藻PCC 6803中參與到碳代謝網(wǎng)絡調控，在對sigE敲除突變株、sigE過表達突變株以及野生型進行蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，SigE具有調控糖原降解以及與光合作用相關蛋白豐度的功能［94］。在集胞藻PCC 6803中，SigE與Rre37共同表達時能夠提高琥珀酸產量［91］，單獨過表達SigE增加了在氮饑餓條件下生物塑料聚羥基丁酸酯的合成［95］。SigE因子在藍細菌中普遍存在，但在不同藍細菌中扮演的調控角色有所差異，在魚腥藻PCC 7120中的SigE與異形胞的形成相關，而在聚球藻PCC 7002中的SigE負責調控某些基因在平臺期的特定轉錄［96-97］。

2.3 sRNA工程在藍細菌中的研究與應用

非編碼RNA在細菌體內大量存在，其中具有調控作用的sRNA還未完全解析。sRNA參與了基因表達的轉錄、翻譯以及轉錄后多個過程的調控，對于胞內穩(wěn)態(tài)的維持作用不言而喻。sRNA與mRNA相互作用的機制較為簡單，已經(jīng)在藍細菌中開發(fā)出對應的調控工具［98］。

2.3.1 sRNA工程在Fe2+缺乏環(huán)境下的作用

水環(huán)境中鐵離子缺乏往往是限制藍細菌的生長條件之一，鐵離子缺乏影響了光合反應中Fe2+或Fe/S復合物依賴性蛋白的活性。在集胞藻PCC 6803中，sRNA IsrR對在鐵離子缺乏、高光脅迫以及氧化脅迫條件下積累的蛋白質IsiA進行負調控，過表達sRNA IsrR突變株在H2O2的條件下響應時間延長，而過表達sRNA IsrR的反義RNA的突變體的響應時間縮短［99-100］，響應時間的減少更有利于菌株對環(huán)境的適應。

2.3.2 sRNA工程在藍細菌光適應以及碳固定中的作用

光照條件影響藍細菌光合反應過程，不同光照條件下參與光合反應的酶的表達量具有差異，這種差異的產生主要由不同光照條件下菌株對相關基因進行精確的差異性表達產生，這個調控過程有sRNA的參與。D1蛋白是光合系統(tǒng)Ⅱ的一個關鍵亞基，由psbA編碼，調控psbA的表達是藍細菌響應光照條件變化調節(jié)光合反應過程的一種方式。在集胞藻PCC 6803中，存在sRNA PsbA2R和PsbA3R，分別調控基因psbA2和psbA3的表達，光照條件下PsbA2R和PsbA3R上調，促進靶標基因的表達，而在黑暗條件下PsbA2R和PsbA3R下調，降低靶標基因的表達［103］。敲除PsbA2R后，psbA2的表達量較對照菌株下降了50%，光合系統(tǒng)Ⅱ的活性下降了15%［103］。

藍細菌在自然界中不僅有黑暗和光照條件的變化，還要應對太陽直射產生的高光條件。因此提高藍細菌高光耐受也是提高工程藍細菌魯棒性的一個重要方面。sRNA能夠調節(jié)藍細菌在不同光照條件下光合系統(tǒng)蛋白的表達量，在高光條件下起到光保護的作用。在集胞藻PCC 6803中，sRNA PsrR1在高光刺激后，能夠在短時間內表達，結合到psaL、psaJ、chlN和cpcAmRNAs的核糖體結合區(qū)域，抑制mRNA的翻譯，進而適應高光環(huán)境［104］。

sRNA還能夠調控光合系統(tǒng)與碳反應之間的平衡。RuBisCO是光合生物體內非常重要的一種酶，能夠催化CO2固定途徑的第1步反應。在集胞藻PCC 6803中，sRNA RblR在高光條件下具有高表達量，能夠通過堿基互補配對結合到編碼了RuBisCO大亞基的rbcL基因的mRNA，增加其穩(wěn)定性，進而促進RbcL的合成［61］，增加CO2固定效率。高光條件下RuBisCO含量增加，促進CO2固定消耗光合系統(tǒng)產生的能量以及還原力，對維持整個系統(tǒng)的平衡具有重要的意義。

藍細菌中同一種sRNA可能參與多種脅迫條件下的調控。在藍細菌中sRNA Yfr1能夠與編碼鈉離子依賴的碳酸氫鹽轉運蛋白sbtA基因的mRNA結合，抑制sbtA的翻譯過程，將sRNA Yfr1敲除后，在正常條件下藻藍蛋白與葉綠素a的含量降低，但能夠正常生長，而在鐵離子缺乏、鹽脅迫、活性氧脅迫以及鈣離子缺乏多種脅迫條件下生長受到抑制［105］。

2.3.3 sRNA工程在化學品生產優(yōu)化中的作用

藍細菌在進行化學品生產過程中，不僅要面臨自然條件下的非生物脅迫，還要面臨生產過程中代謝產物積累所帶來的脅迫。在正丁醇生產過程中，隨正丁醇產量的增加，對藍細菌產生抑制作用，提高底盤正丁醇耐受性是進一步提高正丁醇產量的關鍵。在集胞藻PCC 6803中，過表達sRNA CoaR后，sRNA CoaR與輔酶A合 成相關的基因slr0847和slr0848的mRNA的啟動子位置結合加強，沉默輔酶A合成相關的基因的表達，導致輔酶A積累量減少，同時降低了脂肪酸代謝和能量代謝，使菌株的正丁醇耐受性降低［60］，而敲除sRNAcoaR能夠提高其對正丁醇耐受性［67］。CoaR對輔酶A合成量的調控也證明了其在碳流調控方面同樣具有潛力。

在集胞藻PCC 6803中，對sRNA Nc117進行過表達，提高了對短鏈醇的耐受性，而sRNA Nc117的表達促進了編碼D-甘油-α-D-甘露庚糖1-磷酸鳥苷基轉移酶基因slr0007的表達，進而促進LPS合成途徑，推測LPS的合成是提高短鏈醇耐受性的原因［62，64］。

（5）加強缺陷處理后的養(yǎng)護，防止出現(xiàn)二次缺陷，已處理混凝土表面快要出凝時在表面涂刷一層養(yǎng)護劑，保證涂刷均勻，不漏刷。

3 挑戰(zhàn)與展望

近年來合成生物學研究的發(fā)展極大促進了光合藍細菌的應用基礎研究。值得指出的是，有關藍細菌細胞工廠構建及其挑戰(zhàn)已有很多優(yōu)秀的論文和綜述發(fā)表［106-108］，感興趣的讀者可以進行閱讀。本文中，我們將聚焦在藍細菌中應用調控工程的挑戰(zhàn)與展望。

雖然不少TCS、σ因子以及sRNA的功能及其調控響應機制被逐漸定義，但尚不滿足光合藍細菌中調控系統(tǒng)發(fā)展的需要，仍有大量調控系統(tǒng)元件機器功能未表征。最新研究表明，在酵母中通過隨機裝配耐受相關抗逆基因線路、實驗室進化和多步篩選得到了具有多重耐受性的菌株，實現(xiàn)智能抗逆菌株的構建［109］。而在光合藍細菌中仍需研究不同環(huán)境下響應模塊開發(fā)新的調控工具，以促進光合藍細菌多元抗逆底盤的開發(fā)。以藍細菌為生產底盤進行產品生產時，往往發(fā)現(xiàn)在某一脅迫環(huán)境下更加有助于化學品的生物合成，通過調節(jié)外部脅迫環(huán)境平衡生長與產量之間的關系可以取得較高產品產率［24，110］，但當前調控工程在光合藍細菌中對多基因精確調控的研究不足，很難開發(fā)和應用這樣的調控工具。人工sRNA在光合藍細菌中已有廣泛應用，具有可編程性，極大便利了研究者的使用［111］。因此，為增加調控工程的靈活性，在光合藍細菌中開展對調控系統(tǒng)功能蛋白工程改造的研究也是必要的。

3.1 調控系統(tǒng)功能的闡明

光合藍細菌中調控系統(tǒng)功能未知是影響調控工程應用的主要障礙。對調控系統(tǒng)功能的研究主要包括兩個步驟：①調控系統(tǒng)元件及功能預測；②對預測元件功能進行實驗驗證。

光合藍細菌中調控系統(tǒng)組成部分繁多，逐一鑒定過于煩瑣。借助生物信息學方法，對光合藍細菌調控系統(tǒng)及功能進行預測，能夠減少實驗量，提高效率。篩選后的調控系統(tǒng)元件需要進行功能驗證。在之前研究中，針對未知功能的調控系統(tǒng)元件構建突變體庫［76，80，112］，使用不同環(huán)境條件進行篩選確定不同調控系統(tǒng)元件的功能，但此方法篩選通量低。因此，如圖5（a）所示，在光合藍細菌中基于CRISPR技術，開發(fā)單堿基編輯和CRISPRi等技術，在光合藍細菌中快速完成建庫工作，有望實現(xiàn)對預測調控系統(tǒng)單元的快速篩選［113-115］。最后，通過對高通量篩選出的調控系統(tǒng)單元進行調控途徑研究，解析調控系統(tǒng)單元在特定調控過程中的作用。

3.2 調控工程相關工具的開發(fā)

基于天然調控系統(tǒng)元件，設計基因線路，實現(xiàn)不同條件下特定代謝通路的激活［圖5（b）］，進一步開發(fā)能響應環(huán)境和生理變化對胞內能量、碳流進行分配，平衡生長與生產關系的智能細胞工廠。

研究得較為廣泛的淡水藍細菌的模式菌株集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7942為多拷貝菌株，拷貝數(shù)與菌株生長周期和環(huán)境因素有關［116-118］，而基因組拷貝數(shù)在菌株基因組改造、純合工程菌株篩選中具有重要意義。在聚球藻PCC 7942中，DnaA在光照條件下與DNA復制起始位點結合誘導DNA復制，在黑暗或電子傳遞鏈受到抑制時，DnaA與DNA復制起始位點的結合受到抑制［119］。因此，有望通過調控工程改變信號通路，以達到能夠控制光合藍細菌基因拷貝數(shù)的目的。

此外，基于調控系統(tǒng)開發(fā)新的技術方法。sRNA與靶標依靠堿基互補配對進行作用，其工作原理較為簡單?；诖耍ㄟ^人工設計sRNA靶定到靶基因的mRNA抑制基因的表達，已在藍細菌中進行使用［111］。CcaS/CcaR屬于TCS系統(tǒng)，能夠響應綠光誘導，表達控制基因?；贑caS/CcaR工作原理，控制異丁醇合成關鍵基因的表達，實現(xiàn)生長與生產過程分離，將異丁醇產量提高到238 mg/L［120］。

因此，基于調控系統(tǒng)工作原理開發(fā)更多功能模塊實現(xiàn)復雜基因線路是調控系統(tǒng)研究的一個重要方向。

3.3 多基因的調控

光合藍細菌中部分調控系統(tǒng)單元功能已進行了驗證，見表1。對同一脅迫環(huán)境的響應有多種調控系統(tǒng)的參與，例如鹽脅迫條件下，Hik2、Hik16、Hik33、Hik34、Hik36、Hik41、Hik43、Rre1、Rre6、SigB和Yfr1等均參與到了適應性調控過程中基因表達的不同階段。因此，在進行調控工程時可將多種調控系統(tǒng)元件進行耦合，實現(xiàn)對多個代謝過程同時進行調控［圖5（c）］。比如，在集胞藻PCC 6803中對丁醇耐受性的研究中，sRNA與TCS系統(tǒng)均參與到調控過程［67］，通過對兩個調控系統(tǒng)的同時干預，極大地提高了丁醇的耐受性。與丁醇耐受調控過程相同，在鹽脅迫、高光脅迫或氧化脅迫環(huán)境條件下，有不同調控系統(tǒng)的參與，對這些調控系統(tǒng)單元進行合理的組合適配有望進一步提高菌株耐受性。

表1 藍細菌中調控系統(tǒng)及功能Tab.1 Functions of regulatory system units in cyanobacteria

圖5 調控工程展望總結Fig.5 Prospect of regulatory engineering research

以光合藍細菌為底盤進行產品生產時，產品產量提高的同時會抑制底盤生長導致單位培養(yǎng)體積產品產量降低［120-121］，影響碳平衡和能量平衡。而調控系統(tǒng)參與光合系統(tǒng)電子鏈與碳固定的平衡調節(jié)，如RblR［61］。因此，可以通過調控工程優(yōu)化電子鏈與碳固定之間關系，優(yōu)化生長與生產之間的關系?？刹扇∩L與生產分離的策略，引入群體感應系統(tǒng)，在生長初期能量和碳源僅供底盤生長，當達到一定濃度時，激活生產模塊，此時大量的能量和碳源流向產品，使產量達到最大。此外，活性氧（ROS）在多種脅迫環(huán)境下產生，如高光、鹽以及銅離子缺乏等［15，22］。脅迫環(huán)境下ROS升高可能是脅迫環(huán)境對菌株抑制的主要毒性體現(xiàn)，因此ROS積累問題是增加多種耐受性的潛在靶點。氧化還原調控過程有多種調控系統(tǒng)的參與，這些調控系統(tǒng)具有非常大的潛力降低ROS積累，進而提高菌株耐受性。

使用調控工程，開發(fā)多元抗逆藍細菌底盤。為滿足工業(yè)生產環(huán)境需求，提高藍細菌在多元耐受條件下的耐受性，開發(fā)多元耐受的藍細菌底盤是必不可少的工作。針對多元耐受藍細菌底盤開發(fā)工作，構建智能抗逆藍細菌底盤［20，109，122］。針對已知作用的調控系統(tǒng)元件，借助人工智能對光合藍細菌調控系統(tǒng)進行合理設計組合，并與實驗室進化相結合，進行多元耐受底盤的開發(fā)。

3.4 調控系統(tǒng)的蛋白質工程

在調控系統(tǒng)中，許多蛋白參與調控過程，因此通過蛋白工程，對調控蛋白進行改造，如圖5（e）所示，設計滿足研究者需要的蛋白是進一步推進調控工程的重要步驟。對編碼σ因子、調控蛋白和RNA聚合酶等與調控相關的基因進行易錯PCR建庫后篩選相關表型的非理性蛋白質改造的工作目前已經(jīng)取得一定成果［19，70-73，123-124］。而調控系統(tǒng)蛋白質的理性設計是未來發(fā)展的重要方向。將機器學習與調控蛋白工程相結合，通過機器學習引導調控蛋白的工程改造，優(yōu)化蛋白質功能，是未來發(fā)展趨勢之一［125］。近年來，使用蛋白質工程對天然蛋白進行改造提高酶活性、增強酶穩(wěn)定性、擴大酶譜成為了一種重要方法［126］。將機器學習與蛋白進化相結合，對調控蛋白進行設計，實現(xiàn)調控蛋白的可編程，是未來調控工程的一個發(fā)展方向。

3.5 系統(tǒng)調控工程

系統(tǒng)調控工程是以多方面多層次工程改造細胞調控系統(tǒng)的方式，對菌株全局代謝網(wǎng)絡進行調整的技術概念。調控工程的初級目標是能夠人工設計調控系統(tǒng)單元，對既定靶標進行直接作用。隨著要求的提高，調控系統(tǒng)工程以不同條件下的代謝組學、轉錄組學、蛋白組學以及代謝流分析等大量組學數(shù)據(jù)為基礎，構建光合藍細菌調控系統(tǒng)與代謝網(wǎng)絡之間的關系模型，對調控系統(tǒng)變化后的代謝模式進行預測，在全局范圍內實現(xiàn)代謝網(wǎng)絡的人工設計。光系統(tǒng)能夠接受光強信號進行調節(jié)［15］，適應不同光照強度，而暗反應過程主要利用光系統(tǒng)產生的能量將CO2固定。最近有文章報道，光亦能調控卡爾文循環(huán)過程［127］。光系統(tǒng)效率與碳固定系統(tǒng)相比要高得多，在高光條件下往往需要光系統(tǒng)通過各種形式耗散多余的能量，避免光系統(tǒng)受到損傷。近來有研究表明，通過引入異源合成途徑能夠有效提高光系統(tǒng)效率，在一定程度上降低光損傷［128］。因此，平衡光系統(tǒng)與碳固定系統(tǒng)對于光合效率的提高有重要意義，如圖5（d）所示。光信號可以調控光系統(tǒng)與碳固定系統(tǒng)，引入異源途徑，將異源途徑的表達與內源響應光信號的調控系統(tǒng)進行嵌合，使異源途徑接受光信號調控，進而提高光合藍細菌高光適應能力以及光合效率。在上述調控系統(tǒng)得到充分解析的情況下，結合系統(tǒng)生物學，未來有望實現(xiàn)基于調控工程的細胞全局調控，平衡光反應與暗反應之間的關系。

4 總結

調控工程是提高底盤耐受性，優(yōu)化底盤生長與產品產量，促進光合藍細菌底盤商業(yè)化的可行方法。當前，利用調控工程對產品產量、耐受性以及生長進行理性設計，使三者關系達到最優(yōu)，還具有一定的難度。因此，要加強調控系統(tǒng)元件功能研究工作，刻畫光合藍細菌調控系統(tǒng)網(wǎng)絡，與機器學習等先進科學技術相結合，開發(fā)快速高效的遺傳操作技術，以及微流控等高通量篩選技術，加快調控系統(tǒng)網(wǎng)絡的研究工作。在當前研究基礎上，加快已知功能的調控系統(tǒng)單元轉化，將不同調控系統(tǒng)元件進行耦合。同時，積極結合計算機科學，對調控系統(tǒng)進行模型構建，對調控系統(tǒng)單元變化進行預測，修復調控系統(tǒng)模型，以求能實現(xiàn)對調控模型的精準預測。綜上，未來可望通過調控系統(tǒng)工程進一步的工作，推動具備規(guī)?；瘧脻摿Φ乃{細菌底盤的構建，促進CO2的資源化利用，助力國家“碳達峰”及“碳中和”目標的實現(xiàn)。