崔馨予，吳冉冉，王園明，朱之光，3

（1中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308）

酶促生物電催化（enzymatic bioelectrocatalysis）是指以氧化還原酶為生物催化劑，在電極上發(fā)生的催化反應(yīng)［1-2］。在酶的催化作用下，陽極將底物氧化，產(chǎn)生電子；陰極則可利用電子將底物還原，生成產(chǎn)物（圖1）。根據(jù)電子傳遞方式不同，分為直接電子傳遞（direct electron transfer，DET）和間接電子傳遞（mediated electron transfer，MET）。酶促生物電催化結(jié)合了生物催化劑高活性、高選擇性、溫和反應(yīng)條件，以及電催化可利用可再生電能作為電子源和高能量轉(zhuǎn)換效率的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于生物傳感器和生物燃料電池的構(gòu)建。此外，酶促生物電催化在合成化學(xué)品、生物燃料和材料等方面也開辟了新的研究方向。與傳統(tǒng)生物催化相比，酶促生物電催化利用電極作為電子供體或受體與氧化還原酶的催化反應(yīng)相耦合［3］，無需額外添加其他酶或共底物，還可通過改變電極電勢調(diào)節(jié)催化反應(yīng)的速度和方向，具有更高的系統(tǒng)靈活性和便捷性。

圖1 酶促生物電催化系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic of an enzymatic bioelectrocatalytic system

Nature Catalysis雜志2020年3月刊關(guān)于人工生物催化系統(tǒng)特刊中的8篇綜述有3篇與生物（光）電催化相關(guān)，可見越來越多研究開始關(guān)注利用電化學(xué)、材料科學(xué)等交叉技術(shù)拓展生物催化范疇，并聚焦于可持續(xù)發(fā)展［4-6］。目前酶促生物電催化的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括酶燃料電池（enzymatic fuel cell，EFC）、酶生物傳感器（enzymatic biosensor）和酶電合成（enzymatic electrosynthesis，EES）［3，7-8］。其中，酶燃料電池利用氧化還原酶的催化作用將底物的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能，未來有望為便攜式、穿戴式和植入式電子器件供電［9］。酶電合成利用電能驅(qū)動相應(yīng)酶元件合成目標(biāo)產(chǎn)物，可實現(xiàn)廢棄、冗余電能的高效存儲和轉(zhuǎn)化，以及為高能化學(xué)品合成提供額外的清潔能量［10］。酶生物傳感器則通過酶和目標(biāo)分析物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的電子作為可檢測信號，以獲得有關(guān)目標(biāo)分析物類型和濃度的相關(guān)信息，在健康、環(huán)境、食品等監(jiān)測領(lǐng)域都有應(yīng)用潛力［10］。

酶促生物電催化的特征是在電極界面上發(fā)生氧化還原反應(yīng)。因此，酶的催化行為，以及酶分子內(nèi)部、酶與酶之間、酶與電極之間的電子傳遞是影響酶促生物電催化系統(tǒng)性能的關(guān)鍵因素。本文基于合成生物學(xué)的原理和方法，重點介紹了常用的氧化還原酶元件及其設(shè)計改造策略、多酶模塊組裝與途徑構(gòu)建、固定化酶電極構(gòu)建、界面電子傳遞強化以及相關(guān)的應(yīng)用系統(tǒng)。在總結(jié)最新研究成果的基礎(chǔ)上，希望為未來新型生物電催化劑的開發(fā)、生物電子傳遞機制的研究以及酶促生物電催化產(chǎn)品的拓展提供有益思路。

1 酶元件的設(shè)計改造

1.1 氧化還原酶簡介

根據(jù)輔因子的不同，氧化還原酶分為兩類：一類是以血紅素（heme）、鐵-硫簇（Fe-S）、鉬、銅等為活性中心的金屬酶；另一類是含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、黃 素 單 核 苷 酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）等 的 非 金 屬酶［11-16］。血紅素酶的氧化還原中心由含4個亞甲基橋的吡咯環(huán)組成的卟啉環(huán)以及與中心配位的Fe（Ⅱ）或Fe（Ⅲ）組成［11］。血紅素b作為最常見的血紅素廣泛存在于肌紅蛋白、血紅蛋白和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），分別具有運輸氧、儲存氧和催化過氧化物分解的功能。Fe-S簇氧化還原酶是借助組氨酸或半胱氨酸殘基的含硫配體與鐵離子配位結(jié)合的酶，例如鐵氧還蛋白、氫酶和固氮酶［17-18］。鐵氧還蛋白以電子載體的形式在電子供體和受體蛋白之間傳遞電子，如假單胞氧還蛋白［12］。氫酶中Fe-S簇的主要功能是通過氫氧化保護代謝過程。對于含NiFe和Fe的氫酶，經(jīng)Fe-S簇底物通道將H+/H2從活性位點運送到蛋白質(zhì)表面，與底物進行電子交換［19］。固氮酶通過其催化蛋白（MoFe、VFe和FeFe蛋白）與ATP水解電子轉(zhuǎn)移鐵蛋白（Fe蛋白）的金屬蛋白復(fù)合物解離、ATP水解以及無機磷酸鹽（Pi）形成來實現(xiàn)從N2到氨的合成［20-21］。含銅蛋白主要是利用電子和氧的轉(zhuǎn)移來催化氧化反應(yīng)，通常與氧化有機/無機自由基有關(guān)，它們幾乎只在O2或NOx化合物的代謝過程中起作用，例如漆酶［22］。多銅活性位點的氧化還原電位與蛋白質(zhì)底物的特異性及其氧化酚底物的能力密切相關(guān)，這是由伴隨分子氧還原的熱力學(xué)驅(qū)動決定的［13］。黃素酶是以FAD或FMN為輔酶的一組氧化還原酶，包括很多重要的脫氫酶。當(dāng)一個電子從還原的黃素轉(zhuǎn)移到氧時，會形成超氧化物和黃素自由基組成的復(fù)合物，能夠催化多種氧化反應(yīng)，包括羥基化、環(huán)氧化和Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)，具有很高的區(qū)域選擇性和對映選擇性［23］。PQQ依賴型氧化還原酶通過輔因子Ca2+與脫輔基酶進行配位后，電子通過PQQ從底物轉(zhuǎn)移到血紅素基團，最后轉(zhuǎn)移到電子受體［15］。與NAD［?320 mV，相對于標(biāo)準(zhǔn)氫電極（standard hydrogen electrode，SHE）］或FAD（?450 mV）相比，PQQ能夠在更高的氧化還原電位（+90 mV）下被兩個電子還原［15］，且PQQ氧化態(tài)的C5羰基對醇、氨、胺、氰化物和氨基酸等親核試劑反應(yīng)強烈［24］。此外，一些PQQ依賴型酶可以將電子直接轉(zhuǎn)移到電極表面或?qū)щ娋酆衔铮?5］。

1.2 改造方法與策略

在過去的幾十年中，氧化還原酶的蛋白質(zhì)工程改造在酶促生物電催化領(lǐng)域取得了顯著進展。采用理性設(shè)計、定向進化和組合策略可成功改善酶學(xué)性質(zhì)，包括熱穩(wěn)定性、最適pH、活性/穩(wěn)定性、對鹽的耐受性以及輔酶偏好性等，從而增強電催化性能［26-28］（表1）。

表1 酶元件設(shè)計策略及典型示例Tab.1 Design strategies for oxidoreductases as well as typical examples

1.2.1 定向進化

定向進化是一種模擬自然選擇對酶進行改造的有效方法［52］，包括兩個關(guān)鍵步驟：構(gòu)建含有足夠多突變體的文庫，以及對文庫建立篩選方法［53］。通過定向進化，研究人員增強了葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）的氧化活性并降低了其對氧氣的敏感性，使之更加適用于酶燃料電池和生物傳感器［29，54］。Zhang等［30］建立了一套基于氧化還原電勢的高通量篩選方法，利用多通道恒電位儀搭載多電極陣列對96孔板中表達的漆酶（copper efflux oxidase，CueO）進行評估，從飽和突變文庫篩選出的D439T/L502K突變體顯著降低了陰極氧還原的過電位并將電池輸出功率提高了1.72倍［圖2（a）］。酶促生物電催化系統(tǒng)中降低陽極pH是構(gòu)建高性能酶燃料電池的有效策略，但低pH對一般酶的活性和穩(wěn)定性影響較大，不利于電池的長期運行。Ma等［31］利用定向進化篩選出了耐酸的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH）和 黃遞酶（diaphorase，DI），其pH 5.4下的催化效率與野生型相比分別提高了42倍和4倍，且穩(wěn)定性也有所改善［圖2（b）］。

1.2.2 理性設(shè)計

理性設(shè)計需基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及催化機理的詳細(xì)信息，針對蛋白質(zhì)的活性位點或結(jié)構(gòu)域，利用計算機輔助設(shè)計并且借助各種生物信息學(xué)的工具和算法預(yù)測不同位點突變后對酶活力、底物特異性以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等方面的影響，以改進氧化還原酶的結(jié)構(gòu)和催化活性，使其更適用于酶促生物電催化系統(tǒng)［56］。例 如，將 甲 胺 脫 氫 酶（methylamine dehydrogenase，MADH）位于底物通道具有較大空間位阻的Phe55殘基替換為更小位阻的丙氨酸后，對組胺的Km比野生型為原來的1/400，其構(gòu)建的組胺生物傳感器檢測限比野生型降低了400%［33］。Wegerich等［34］在人細(xì)胞色素c血紅素基團附近引入帶正電荷的賴氨酸，獲得的E66K突變體與超氧化物的反應(yīng)速率常數(shù)提高了1倍并顯示出良好的穩(wěn)定性，使超氧化物傳感器靈敏度提高了約40%。Hiraka等［35］通過計算分析L-乳酸氧化酶（lactate oxidase，LOx）中氧氣傳遞途徑，證明A96L突變體能夠有效阻斷氧通路，極大減少氧氣對傳感器的干擾，將L-乳酸濃度響應(yīng)電流的線性范圍擴大了10倍。除了改善催化性能，定點突變也可用于改變輔酶或電子中介體的偏好性或底物特異性，提高酶應(yīng)用于生物電催化系統(tǒng)的穩(wěn)定性。研究表明，將6PGDH與輔酶結(jié)合的相關(guān)位點突變?yōu)橹付ò被幔∟32E/R33I/T34I）后，輔酶特異性從NADP轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD，相應(yīng)電池電流密度比野生型提高約25%［圖2（c）］［32］。另一研究發(fā)現(xiàn)對葡萄糖脫氫酶（FAD glucose dehydrogenase，F(xiàn)ADGDH）同源建模設(shè)計的S326Q/S365Y雙突變體，其對葡萄糖的特異性提高了30倍，使得相應(yīng)生物傳感器不再受真實樣品中麥芽糖的干擾［36］。

1.2.3 非天然氨基酸的引入

天然酶元件利用氧化還原活性氨基酸殘基（Tyr、Trp、Met、Cys等）與輔因子作為氧化還原中心，相對于標(biāo)準(zhǔn)氫電極，氧化還原電位在?700～+800 mV，覆蓋1.5 V的范圍［圖2（d）］［55，57］。近年來，遺傳密碼的擴展使得一些具有新官能團和化學(xué)性質(zhì)的非天然氨基酸（unnatural amino acids，UAA）能夠被引入酶的特定位點，以改善酶的氧化還原電勢，優(yōu)化電子轉(zhuǎn)移速率和人工酶的活性，可作為改造氧化還原酶的一種新策略［58-60］。例如，將肌紅蛋白（myoglobin，Mb）中的Tyr-Cys替換為非天然氨基酸后，突變酶以800 min?1的速率還原羥胺，比野生型提高3倍［37］。此外，非天然氧化還原輔因子也可以替換結(jié)構(gòu)相似的天然輔因子，構(gòu)建高活性和選擇性的人工金屬酶。Hartwig等［38，61］將含有銥等貴金屬的金屬卟啉作為非天然氧化還原輔因子引入肌紅蛋白和P450中可進行有效的卡賓轉(zhuǎn)移反應(yīng)；將3-甲氧基酪氨酸OmeY整合到抹香鯨肌紅蛋白功能性氧化酶中，氧化還原電位比Tyr降低179 mV，進一步揭示了調(diào)整Tyr的還原電位在氧化酶反應(yīng)中的積極作用［39］。

圖2 氧化還原酶的改造方法與策略Fig.2 Methods and strategies of engineering oxidoreductases

2 多酶模塊組裝與途徑構(gòu)建

2.1 多酶復(fù)合體模塊

與單酶催化相比，多酶介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)通過模擬生物體內(nèi)的多酶協(xié)同高效催化，可應(yīng)用于單酶不能有效催化的反應(yīng)中，成為合成生物學(xué)的研究熱點［62］。然而，基于多酶反應(yīng)的生物電催化系統(tǒng)由于其復(fù)雜性，也面臨很大的挑戰(zhàn)，包括每種酶的最佳操作條件不同，限速酶影響系統(tǒng)性能，以及難以回收所有酶。共固定化多酶可通過減少聚集、防止亞基分離、酶自溶或水解以及創(chuàng)造有利的微環(huán)境來提高穩(wěn)定性［63］。有效的共固定化應(yīng)模擬細(xì)胞內(nèi)的多酶復(fù)合體，使多種酶在空間上相互靠近，使底物或中間物從一個酶的活性中心有效地轉(zhuǎn)移到另一個酶的活性中心，不僅可縮短轉(zhuǎn)運和反應(yīng)時間，還能減少擴散引起的中間物損失，同時產(chǎn)生更少的副產(chǎn)品和污染物。最近，多酶復(fù)合體在酶促生物電催化中被廣泛應(yīng)用［64-67］，可提升系統(tǒng)的能量轉(zhuǎn)化效率、提高反應(yīng)特異性、擴展檢測范圍［68-71］。

多酶復(fù)合體模塊可以通過以下幾種方式來組裝：

（1）交 聯(lián) 酶 復(fù) 合 物（cross-linked enzyme aggregates，CLEA）涉及蛋白質(zhì)分子之間共價鍵的形成，是一種通過用化學(xué)試劑來激活或耦聯(lián)電極表面和多酶模塊的新穎且通用的策略［72-73］。通過使用交聯(lián)的己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）的雙酶復(fù)合物氧化葡萄糖，可提高功率密度［74］。此外，代謝途徑的順序酶之間的相互作用會誘導(dǎo)底物通道的形成并提高催化效率［75］。例如，通過利用Krebs cycle代謝區(qū)室里共價連接的多酶取代非復(fù)合體酶制備的生物電催化劑，丙酮酸/空氣酶燃料電池的電流密度可以提高49%［圖3（a）］［76］。

（2）蛋白支架是根據(jù)蛋白相互作用，以支架蛋白為結(jié)構(gòu)核心將多種酶元件對接而成的多酶自組裝體［78］。例如，Meng等［79］構(gòu)建的纖維糊精磷酸化酶與磷酸葡萄糖變位酶雙酶復(fù)合物，通過下游酶拉動上游酶克服熱力學(xué)瓶頸，將電流密度提高了3倍。Fan等［77］將葡糖淀粉酶和GOx通過與cohesin-dockerin相互作用共展示到酵母細(xì)胞表面構(gòu)建的酶級聯(lián)反應(yīng)，顯著提高了酶燃料電池的最大功率密度［圖3（b）］。但由于每種酶都需要使用不同的載體進行展示，且氧化還原酶空間種類受限，導(dǎo)致酶拷貝數(shù)較低，影響酶級聯(lián)反應(yīng)的有序組裝［80］。

圖3 多酶復(fù)合體模塊組裝策略Fig.3 Strategies of multienzyme complex assembly

（3）核苷酸支架是利用DNA或RNA分子為支架結(jié)構(gòu)與酶的特異性結(jié)合功能，將多酶元件聚集到支架結(jié)構(gòu)形成的高效有序酶組裝系統(tǒng)。使用交聯(lián)寡脫氧核苷酸作為支架，將GOx-抗生物素蛋白和HRP-抗熒光素Fab蛋白分別組裝在金電極上，可用于葡萄糖傳感，且電流信號與在電極表面核苷酸支架上的酶結(jié)合位點密切相關(guān)［71］。然而單鏈DNA支架由于缺乏剛性可能導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的錯誤折疊，可考慮在二維核酸“折紙”支架上進行可控共組裝［81］。

2.2 多酶催化途徑的構(gòu)建

基于多酶催化的生物電催化系統(tǒng)憑借高活性和高選擇性，可用于多步轉(zhuǎn)化過程和具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的目標(biāo)產(chǎn)物合成。與用于物質(zhì)轉(zhuǎn)化的多酶催化途徑相似，用于生物電催化的多酶途徑主要科學(xué)問題也在于其組成的各元件和模塊之間的適配性。由于還涉及電子傳遞和不同形式的能量轉(zhuǎn)化，以及電極等非生物元件的參與，該系統(tǒng)變得更加復(fù)雜。例如，Minteer課題組［50］開發(fā)了一種生物電催化N2固定的多酶系統(tǒng)，N2首先由固氮酶（MoFe nitrogenase）以甲基紫精作為電子中介體催化生成NH3，再通過由黃遞酶、L-丙氨酸脫氫酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶組成的多酶級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)了電驅(qū)動固氮合成手性胺，最高法拉第效率達到27.6%［圖4（a）］。其中，通過條件優(yōu)化實現(xiàn)對氧氣極度敏感的固氮酶和其他電催化元件之間的協(xié)同是一個難點。Zhu等［82］構(gòu)建了含有糖磷酸化、電子生成和葡萄糖6-磷酸（glucose 6-phosphate，G6P）再生三大模塊且不涉及ATP或CoA的多酶途徑［圖4（b）］。值得注意的是，該途徑以G6P作為“通用接口”，將3個功能模塊完美對接，通過改變底物能量激活模塊中的糖磷酸化酶，可實現(xiàn)對淀粉糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖乃至生物質(zhì)糖等多種糖的完全利用，體現(xiàn)了合成生物學(xué)模塊“即插即用”的特性，大大拓展了電池的底物譜。Kim等［83］將3種不同來源的NAD（H）依賴型醇脫氫酶、醛脫氫酶和甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）自組裝進水凝膠中，可催化1分子甲醇完全氧化同時產(chǎn)生3分子NADH，并用這些還原力進行產(chǎn)電。

圖4 基于多酶催化的產(chǎn)物合成途徑Fig.4 The multienzyme-catalyzed pathways for product synthesis

3 酶電極構(gòu)建與生物-非生物界面電子傳遞強化

3.1 酶的固定

生物催化劑和電極之間的電子傳遞將生物反應(yīng)和電化學(xué)過程相關(guān)聯(lián)，因而深入研究電子傳遞機制對于理解氧化還原酶的構(gòu)效關(guān)系至關(guān)重要，也是酶促生物電催化反應(yīng)器、電極和反應(yīng)過程設(shè)計的理論基礎(chǔ)。界面電子傳遞速率高度依賴于酶活性位點與電極之間的表面距離，當(dāng)該距離低于1.4 nm且不需要任何電子中介體（electron mediator）即可進行電子傳遞的方式，稱為直接電子傳遞（DET），對于需要電子中介體的則為間接電子轉(zhuǎn)移（MET）［84］。在實際應(yīng)用中，中介體的電子特性必須與目標(biāo)生物電催化反應(yīng)的類型相匹配，如常用的甲基紫精、蒽醌和中性紅等［85-87］。

為了提高酶促生物電催化系統(tǒng)性能，需要維持酶的活性及在電極表面的較高濃度，使酶與電極有效耦聯(lián)，往往需要將酶固定化至電極［88］。酶固定化主要分為吸附（包括共價和親和）、包埋、交聯(lián)等。酶在電極表面的吸附本質(zhì)上是依賴分子間作用力的物理結(jié)合策略，如疏水相互作用、范德華力、離子相互作用和共價作用等［89］。常用載體有聚乙烯亞胺、聚-L-賴氨酸和聚苯胺［90-92］。吸附法雖然保留了酶的結(jié)構(gòu)和活性并與電極表面建立了良好的親和力，但由于分子間作用力和對酶的選擇性較弱，導(dǎo)致維持時間相對短暫。因此，可以通過對酶-電極表面修飾或酶改造提高酶-電極的親和力［93］，例如將FDH成功吸附在功能化電極表面［94-96］。包埋則不需要酶和聚合物結(jié)構(gòu)之間的特定作用，通過共價或非共價作用可將酶包裹在聚合物結(jié)構(gòu)中并固定在電極表面［97-98］。最常用的聚合物試劑有Nafion和殼聚糖，此外包括Os電沉積聚合物、甲苯胺藍以及聚吡咯、聚苯胺在內(nèi)的導(dǎo)電聚合物也可以促進電極表面和酶活性氧化還原中心之間的直接電子轉(zhuǎn)移［65，99-103］。交聯(lián)法往往涉及化學(xué)試劑，可能使酶結(jié)構(gòu)改變并降低其活性，可考慮摻入惰性蛋白以降低目標(biāo)蛋白的失活。

氧化還原酶在電極表面的定向固定，可縮短氧化還原酶和電極間的電子傳遞距離，有時可以將原本不可進行DET的酶實現(xiàn)DET［圖5（a）］。酶的改造是實現(xiàn)酶定向固定的有效方法之一，常用方法是給酶表面添一個接頭，以提供酶在電極上的定向固定位點［29］（表1）。例如，由C端添加了His-tag的HRP制備的酶多肽吸附金電極，顯示出明顯的DET特征，并且對H2O2的靈敏度提高了100倍以上［40］。Lee等［41］設(shè)計了在N端或C端帶有金 結(jié) 合 肽（gold binding peptide，GBP）的FADGDH，實現(xiàn)了酶在金電極上的定向固定，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的電流［圖5（b）］。除了特異性的定向結(jié)合，小分子修飾可能會引起蛋白的構(gòu)象變化，從而暴露某些結(jié)合位點以實現(xiàn)酶的定向固定。此外，通過定點突變引入新氨基酸從而形成新共價鍵，是實現(xiàn)酶定向固定的另一策略。例如，利用電極表面上修飾的丁烯二酰亞胺基團與在酶表面特定位置引入的半胱氨酸殘基耦聯(lián)形成巰基，可用于膽紅素氧化酶的定向固定，并展現(xiàn)出更快的DET與更高的穩(wěn)定性［42］。以類似方式制備的纖維二糖脫氫酶（cellobiose dehydrogenase，CDH）、漆酶、多銅氧化酶，極大改善了DET型酶促生物電催化的性能，提高了酶與電極的電子傳遞效率［104-105］。

圖5 氧化還原酶的定向固定Fig.5 Directed immobilization of oxidoreductases

除了對酶進行改造，電極修飾材料的選擇以及修飾活性官能團也是實現(xiàn)酶定向固定的方式［106-108］。最近Muguruma等［45］研究表明，在金電極上修飾的單壁碳納米管（single walled carbon nanotube，SWCNT），可以靠近FAD活性中心的凹槽實現(xiàn)FADGDH的有效DET［圖5（c）］。針對碳基電極可使用硝酸、硝酸銨、過硫酸銨、乙二胺、4-（N，N-二甲氨基）苯重氮和聚苯胺等進行化學(xué)修飾［106-109］。Wang等［43］將NiFe氫酶（PfSHI）固定在4-甲基芐胺修飾的氨基化多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotube，MWCNT）上，證明PfSHI靠近疏水表面時改變了空間構(gòu)象并且在電極上重新定向。對金屬電極進行修飾，可以防止特定氨基酸與裸金屬電極相互作用而引起的潛在酶構(gòu)象變化，并降低電子傳遞的活化能。CDH［44］、CueO［110］和亞硫酸鹽氧化酶［111］的研究結(jié)果表明，金屬表面形成的自組裝單分子層可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與電極之間的靜電作用。此外，有報道將人工去除了輔因子的黃素酶（apoflavoenzymes），例如缺少了FAD的GOx，重組到具有單層輔因子膜的電極表面，制備出了高效DET酶電極［圖5（d）］［46，112-113］。

3.2 界面生物電子傳遞強化

氧化還原酶的改造是常用的調(diào)控界面電子傳遞性能方法（表1）。酶的活性位點通常埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，通過刪除在C端、N端或Loop區(qū)域不維持蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的非必需氨基酸殘基，可以縮短原始電子傳遞途徑，使活性位點更加靠近電極表面［25］。Wang等［47］構(gòu)建了截短的只含2個亞基的PfSHI，縮短了酶和電極之間的電子傳遞距離，表現(xiàn)出比4亞基野生型更高的電子傳遞速率。也有報道，通過同源建模構(gòu)建截短的血紅素3組成電子轉(zhuǎn)移亞基的FADGDH，可以從原本不能DET變?yōu)榭梢訢ET［圖6（a）］［48］。另一種縮短活性位點與電極之間距離的有效方法是去糖基化。將一些不導(dǎo)電的糖基從氧化還原酶表面移除，使電極表面酶分子量變小，有助于輔基和電極的緊密接觸，增強DET的能力［圖6（b）］［49］。例如，利用去糖基化后的CDH修飾的石墨電極，底物加入后的最大催化電流比野生型高40%～65%［49］。該策略也應(yīng)用在GOx和HRP中以提高DET［114-115］。此外，可利用引入UAA的方法來在人工酶中安裝氧化還原中心，以優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域間或酶與電極之間的電子傳遞。例如，利用硼二吡咯甲烯將特異性摻入非天然氨基酸TF的甘氨酸氧化酶和L-色氨酸氧化酶連接在電極表面，可以促進電子轉(zhuǎn)移實現(xiàn)DET，并構(gòu)建出相應(yīng)的生物傳感器［圖6（c）］［116］。

由于很多氧化還原酶的反應(yīng)需要價格昂貴的輔酶［如NAD（H）及NADP（H）］的參與，輔酶模塊的有效再生也是酶促生物電催化中的關(guān)鍵和難點。其再生方法主要包括酶法、電化學(xué)法和光化學(xué)方法［117］，電化學(xué)法的優(yōu)勢在于成本低、綠色環(huán)保、無副產(chǎn)物生成以及無需其他化學(xué)反應(yīng)試劑等，但對還原介質(zhì)的選擇具有一定的局限性，反應(yīng)時需要較高的電位并可能會導(dǎo)致輔酶二聚體的產(chǎn)生［118］。例如，在生物電催化固氮系統(tǒng)中，陰極基于甲基紫精（methyl viologen，MV）介導(dǎo)了固氮酶和黃遞酶的催化反應(yīng)，電流密度較無MV提高了40%［50］。構(gòu)建酶-輔酶交聯(lián)復(fù)合體可以拉近輔酶與酶的距離，將其限域在酶周圍，有效促進電子傳遞和輔酶再生。Song等［51］將FDH與NADH共價交聯(lián)，固定在銅納米顆粒修飾的電極上，酶電催化固定CO2的法拉第效率為22.8%，比使用FDH和游離NADH高出約2.5倍［圖6（d）］。最近，由含氧化還原基團的側(cè)鏈及非導(dǎo)電主鏈構(gòu)成的氧化還原聚合物，在電極修飾策略方面也受到了關(guān)注，可促進電子傳遞［119-120］。氧化還原聚合物主要包括二茂鐵和過渡金屬配合物以及紫精、醌、Os和2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物等有機聚合物［121］。Mao等［122］設(shè)計了一種新型Os2+/Os3+復(fù)合物氧化還原水凝膠，間隔連接到聚合物主鏈，成功將GOx的FAD/FADH2活性位點與電極相連，可以在低至?0.36 V的電位下氧化葡萄糖。然而，這種方法往往需要使用有毒試劑，并且對酶進行化學(xué)修飾可能會影響底物或產(chǎn)物的擴散速率。

圖6 界面生物電子傳遞強化策略Fig.6 Strategies of enhancing the electron transfer at the enzyme-electrode interface

酶促生物電催化系統(tǒng)中，電極不僅是電流收集器，還是支撐生物催化劑的基礎(chǔ)，涉及固-液或固-液-氣非均相氧化還原反應(yīng)。電極材料應(yīng)具備出色的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性、高比表面積和機械強度、低成本、環(huán)保、耐腐蝕且生物相容等［123-125］。碳基電極是使用最廣泛的電極，包括碳紙、碳布、碳網(wǎng)和碳納米管等［126］，但它賦予電極表面疏水特性，通常會限制氧化還原酶的固定效果，影響界面電子傳遞。因此，通常會利用金屬氧化物納米復(fù)合材料或?qū)щ娦圆牧蠈﹄姌O進行表面修飾［127］。例如，利用碳納米管、納米粒子等納米材料的修飾，為酶的附著提供了3D導(dǎo)電框架［123，127］。另一個策略是改變電極的理化性質(zhì)，以增強酶固定效果和界面電子傳遞，如通過氣體［128］、氰尿酰氯［129］、殼聚糖［130-131］和三聚氰胺［132］等處理。

4 應(yīng)用系統(tǒng)

4.1 酶燃料電池

隨著對清潔和可持續(xù)能源不斷增長的需求，以及可穿戴和可植入電子設(shè)備的快速發(fā)展，綠色安全和高生物相容性的電池成為研究熱點［133-135］。EFC由于使用可再生生物催化劑和高能量密度的燃料，具有較高的生物相容性，得到廣泛關(guān)注［136-138］（表2）。EFC可以利用糖類［146］、醇類［147］、有機酸類［148］和氫氣［149］等多種化合物作為燃料，這些燃料可以來自于生物體自身，或者自然界的生物系統(tǒng)。例如，帶有植入EFC的蝸牛將能夠在自然環(huán)境中運行，可持續(xù)性激活生物電子設(shè)備，并通過蝸牛進食產(chǎn)生的葡萄糖實現(xiàn)連續(xù)運行［150］。Rogers課題組［151］基于EFC設(shè)計了一種自供電的無線電子傳感設(shè)備，具有輕量級、小型化和低成本的優(yōu)勢，可同時監(jiān)測葡萄糖、乳酸、pH和出汗率。該裝置利用Nafion固定的LOx作為生物陽極，涂有鍍鉑碳的金電極作為陰極，產(chǎn)生的電壓信號與葡萄糖濃度成正比。此外，在兩天內(nèi)對兩名受試者檢測顯示，汗水和血液中的葡萄糖和乳酸濃度之間有良好的一致性，為無創(chuàng)、半定量的人體健康監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。

表2 酶生物電催化應(yīng)用系統(tǒng)Tab.2 Application systems of enzymatic bioelectrocatalysis

續(xù)表2

續(xù)表2

EFC的能量密度和功率密度對于其應(yīng)用至關(guān)重要。大多數(shù)葡萄糖EFC基于GOx或GDH，每分子葡萄糖實際上僅產(chǎn)生理論24個電子中的2個［152-153］。Zhu等［66］通過多酶催化途徑，首次實現(xiàn)了糖底物的完全氧化，意味著以0.15 kg/L麥芽糊精為燃料的EFC可具有596 A·h/kg的儲能密度。Shi等［154］近期還實現(xiàn)了生物質(zhì)中的葡萄糖和木糖到電能的完全轉(zhuǎn)化，意味著通過EFC有望從自然界廣泛存在的生物質(zhì)糖獲取綠色和便捷的電能。此外，為了提高EFC的輸出功率（包括電壓和電流的提升），研究者從氧化還原介質(zhì)開發(fā)、電極材料創(chuàng)制、酶定向固定等多個方面進行了一系列嘗試。例如，通過結(jié)合吩噻嗪或醌類衍生物修飾的氧化還原聚合物生物陽極，可以將葡萄糖/氧氣EFC的開路電壓（open circuit potential，OCP）提高至0.6～0.8 V［155］?；谳刘鳛殡娮又薪轶w并替代氧化還原聚合物水凝膠，能夠在低電位下促進GOx氧化葡萄糖，達到5400μA/cm2的最大電流密度。然而，這些氧化還原介質(zhì)會影響生物相容性、穩(wěn)定性和增加成本［134，156］。從這個角度看，開發(fā)低氧化還原電位、高生物相容性和穩(wěn)定性、良好的傳質(zhì)滲透性和對酶高親和力的氧化還原聚合物具有重要意義。除了導(dǎo)電材料，酶的結(jié)構(gòu)與種類對電池性能也很關(guān)鍵。例如，F(xiàn)eFe氫酶相比于NiFe氫酶催化H2產(chǎn)電的過程更加容易被氧氣不可逆影響，從而使相應(yīng)的EFC性能衰退［157］。FADGDH相比于其他GDH類型會表現(xiàn)出較低的氧化還原電位，其EFC能實現(xiàn)更高的功率輸出［158-159］。此外，在氧化還原輔因子中，F(xiàn)AD與酶結(jié)合更緊密，不會隨著時間的推移而解離，使酶的穩(wěn)定性更好，EFC穩(wěn)定性也更佳［160］。像CDH這類含有作為內(nèi)置負(fù)責(zé)電子傳遞的細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域從而可以DET的酶，在EFC中越來越得到關(guān)注［161］。通過定向固定、酶工程或電極表面修飾，使酶或輔因子更接近電極表面，也是提高生物電極電流密度的重要策略。

4.2 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器（electrochemical biosensor）是商業(yè)上最成功的生物傳感器之一，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品工業(yè)、生物技術(shù)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域［139-141］（表2）。因其低成本、相對快速和簡單的分析過程以及小單元的測量尺寸而廣受歡迎［162-166］。通常，其依賴于酶催化反應(yīng)的瞬時性、對底物的高度特異性和相對穩(wěn)定性，通過氧化或還原特定底物產(chǎn)生電子并轉(zhuǎn)移至電極表面，再根據(jù)檢測到的電信號將分析物濃度輸出為可量化信號［167-168］。生物傳感器的類型主要分為電流式、電位式、電導(dǎo)式和阻抗式［169-173］。根據(jù)其電子傳遞機制，生物傳感器分為3代：第1代為采用氧化酶，基于氧化產(chǎn)生的過氧化氫形成電流響應(yīng)來檢測。第2代為利用合適的電子中介體在酶與電極之間通過MET來產(chǎn)生電流響應(yīng)。如市售的FreeStyle Libre血糖儀，利用Os復(fù)合體作為電子中介體連接GOx與工作電極，在40 mV（vs.Ag/AgCl）的電位下氧化葡萄糖進行血糖監(jiān)測［174］。第3代生物傳感器基于可以DET的氧化還原酶，無需電子中介體就可以在較低的電勢下運行，且其特異性受抗壞血酸等電活性干擾物的影響較小。由于并非所有的氧化還原酶都能夠進行DET，與現(xiàn)有的第1代和第2代生物傳感器相比，現(xiàn)僅存在一種市售的第3代生物傳感器（LactoSens）［175］。

開發(fā)第3代生物傳感器是現(xiàn)在的研究熱點，其性能關(guān)鍵取決于DET速率［142-143］。DET加快可提高轉(zhuǎn)化數(shù)和靈敏度及降低檢測限，還有助于減小極化電位，從而減少工作電極上的干擾反應(yīng)、提高傳感器選擇性。目前研究集中在含F(xiàn)AD、FMN、血紅素、PQQ、鉬、鐵硫簇或銅為輔基的氧化還原酶與電極的DET上。用于過氧化氫檢測的第3代生物傳感器采用多晶金電極搭配重組HRP，其靈敏度為1400 μA·L/（mmol·cm2）［176］。煙草過氧化物酶與HRP相比，具有更廣pH范圍的適應(yīng)性及更高的靈敏度，在硫醇修飾的金電極上固定過氧化物酶產(chǎn)生了高出多倍的電流［177-178］。Shipovskov等［179］在具有自組裝單層（self-assembled monolayer，SAM）或Os聚合物的修飾金電極固定茶堿氧化酶，相關(guān)生物傳感器檢測茶堿的靈敏度分別為52.1μA·L/（mmol·cm2），檢測范圍為3.6～72 mg/mL。由于CDH具有進行DET的能力且底物特異性高，通過適當(dāng)?shù)拿父脑?，除了纖維二糖，還可用它實現(xiàn)乳糖的檢測［180-182］。例如，Gorton等［180］將分散在殼聚糖溶液中的高介孔碳?xì)饽z固定在玻碳電極表面，制備基于CDH的乳糖生物傳感器靈敏度為133.7μA·L/（mmol·cm2）。

4.3 酶電合成

與通過在陽極氧化燃料產(chǎn)生電子的EFC相反，EES通常在陰極通過電能驅(qū)動底物被酶催化還原為產(chǎn)物［183］，根據(jù)電子傳遞不同也分為DET和MET［184］。單酶生物電合成系統(tǒng)主要用于合成簡單化合物或引入官能團和手性中心，而多酶級聯(lián)的生物電合成系統(tǒng)可執(zhí)行多步轉(zhuǎn)化過程和復(fù)雜結(jié)構(gòu)產(chǎn)品的合成［145］（表2）。

目前，EES可利用的底物包括CO2、N2、NO2?、醇類等，而產(chǎn)物包括甲酸鹽、甲醇、NH3、H2和烷烴，以及一些高附加值的化學(xué)品和藥品。例如，含有活性金屬中心Mo［185-186］或W［187-188］的FDH可有效用于酶電催化還原CO2，能以優(yōu)異的反應(yīng)速率進行甲酸合成。這些酶通常來自厭氧極端微生物，并涉及復(fù)雜的多域電子傳遞機制。除了甲酸，甲醇也可通過模擬自然光合作用和依賴多酶途徑的酶促光電化學(xué)池中由CO2合成［189］。近期報道的通過釩固氮酶的VFe蛋白將CO2還原形成C－C鍵變?yōu)橐蚁┖捅┑难芯浚瑸镃O2轉(zhuǎn)化成碳?xì)浠衔锾峁┝艘环N新的路線［144］。N2也可作為酶促生物電催化的底物，可通過固氮酶實現(xiàn)N2還原為NH3

［20，190］。例 如，Lee等［191］利 用 固 氮 酶 的MoFe蛋白實現(xiàn)了H+到H2、N3?到NH3、NO2?到NH3的生物電催化反應(yīng)。鑒于EES通常需要氧化還原介質(zhì)，會導(dǎo)致大量的過電位和復(fù)雜的酶動力學(xué)，Hickey等［192］設(shè)計了一個以DET模式將N2生物電合成NH3的系統(tǒng)。其他產(chǎn)品的EES也有相關(guān)報道。例如，利用醛脫甲酰加氧酶從醛和醇中進行酶促電合成辛烷到丙烷的一系列烷烴［193］?；谳o因子再生的EES應(yīng)用也越來越多，例如L-谷氨酸的光電合成［194］、利用D-乳酸脫氫酶生產(chǎn)D-乳酸［195］以及對映選擇性酮還原和還原胺化反應(yīng)［196］等。EES也在生產(chǎn)高附加值化學(xué)品中展示了巨大潛力，包括氨基酸［197］、左旋多巴［198］、R-左旋二酮［199］、聚羥基丁酸酯［69，200］和R-L-苯基乙醇［201］等。

5 前景展望

在這篇綜述中，我們討論了酶促生物電催化的合成生物學(xué)構(gòu)建及應(yīng)用。蛋白質(zhì)工程是提高生物電催化劑性能的有效方法。MET和DET是兩種主要的電子傳遞機制，對酶促生物電催化系統(tǒng)的設(shè)計至關(guān)重要。電極材料和修飾方法的發(fā)展提高了生物電催化器件和系統(tǒng)的性能。近年來，酶促生物電催化已廣泛應(yīng)用于生物傳感器、生物電能和化學(xué)品的合成，雖然其潛力巨大并且取得了一些突破性進展，但仍需要發(fā)展適用于相關(guān)工程應(yīng)用的基礎(chǔ)理論和技術(shù)方法，以促進其市場化應(yīng)用。

合成生物學(xué)作為生物化學(xué)、計算機和工程學(xué)等多學(xué)科相融合的交叉學(xué)科，結(jié)合了生物學(xué)的研究性質(zhì)和工程設(shè)計原則，在生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、生化產(chǎn)品和生物能源的生產(chǎn)等領(lǐng)域都有重要指導(dǎo)作用［202］。雖然以氧化還原酶為催化劑的生物電催化系統(tǒng)已經(jīng)取得了顯著成果，但在實際應(yīng)用中仍然面臨巨大挑戰(zhàn)，如電子傳遞速率低、酶穩(wěn)定性差、成本高等。未來的研究可從以下3個方向來進行：

（1）設(shè)計改造電活性生物元件在酶促生物電催化系統(tǒng)中，氧化還原酶是催化目標(biāo)底物轉(zhuǎn)化以及電子傳遞的核心元件。設(shè)計改造氧化還原酶的活性中心以提高電子傳遞速率和效率的研究應(yīng)是未來的重點方向［203］。除了通過蛋白質(zhì)工程對氧化還原酶本身進行設(shè)計和改造，開發(fā)更多電活性生物元件，也有助于促進界面電子傳遞和關(guān)于電催化機理的深入研究［204］。此外，需要開發(fā)更多適用于電活性生物元件的設(shè)計與改造方法，包括針對于氧化還原電勢的高通量篩選、基于電耦合強度計算的蛋白電子通道設(shè)計等。隨著AlphaFold等新技術(shù)的涌現(xiàn)，更多的酶結(jié)構(gòu)可被預(yù)測，也為設(shè)計電活性生物元件提供了更多可能。

（2）拓寬反應(yīng)電勢/電壓受生物化學(xué)反應(yīng)電勢的限制，酶促生物電催化系統(tǒng)的實際應(yīng)用也存在一些問題，例如電池輸出電壓小、電合成電勢窗口窄等。傳統(tǒng)燃料電池的串聯(lián)組裝可用于EFC的輸出電壓放大，同時拓展EES的電勢范圍，而并聯(lián)連接可增加電流密度［134］。例如通過5個獨立電池串聯(lián)而成的絲網(wǎng)印刷EFC，其產(chǎn)生的電壓可直接點亮LED燈［205］。然而，通過串聯(lián)的系統(tǒng)整體性能會受最差單元的限制。因此，系統(tǒng)的堆疊需要可控、可重復(fù)，尤其是在材料的制備和酶的固定化方面。利用金屬引線串聯(lián)時，需要避免離子導(dǎo)電電解質(zhì)引起的短路，如采用超疏水表面為電解池或電池之間建立離子隔離等。除串聯(lián)外，還可通過連接電荷泵作為DC-DC轉(zhuǎn)換器來提高系統(tǒng)輸出電壓。例如，采用升壓轉(zhuǎn)換器后，可實現(xiàn)將葡萄糖/O2型EFC提供的能量較低的電子轉(zhuǎn)化為能量較高的電子，并用于電解水［206］。此外，降低電催化反應(yīng)的過電勢也是酶促生物電催化系統(tǒng)的研究重點。例如，將CO2電還原與甘油電氧化相結(jié)合，可降低反應(yīng)槽電壓、節(jié)省反應(yīng)耗電量、降低成本并獲得高附加值還原產(chǎn)物［207］。

（3）反應(yīng)器和系統(tǒng)放大在酶促生物電催化系統(tǒng)中，生物元件、電極材料、電子中介體等共同構(gòu)成了一個復(fù)雜的系統(tǒng)。除聚焦生物本身的特性和工程改造之外，電極材料的理化特性、表面結(jié)構(gòu)、生物相容性等對酶-電極相互作用和生物電催化系統(tǒng)的性能也起著至關(guān)重要的作用。已開發(fā)出很多具有新結(jié)構(gòu)、特性和功能的先進電極材料，可增強生物催化劑和電極之間的電化學(xué)通信［123-124，208-209］。根據(jù)不同酶元件的結(jié)構(gòu)特性，構(gòu)建高生物相容性的有機/無機-生物雜合系統(tǒng)，可以進一步拓寬生物電催化系統(tǒng)在電能輸出、電化學(xué)合成、生物傳感等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。目前，酶促生物電催化系統(tǒng)仍處于實驗室水平，除受酶活性和穩(wěn)定性、多酶催化電子傳遞效率等問題的限制外，最大的問題之一是反應(yīng)器難以放大。擴大系統(tǒng)的電極面積或反應(yīng)器體積，其功率無法成比例提升，反而會增大系統(tǒng)內(nèi)阻、徒增損耗，不利于整體性能的提高。電極的三維化是提高其比表面積、增大電流的有效手段。在反應(yīng)器層面，實驗室規(guī)模上常用的反應(yīng)器是H型兩室反應(yīng)器，但由于高內(nèi)阻限制了擴大到中試或工業(yè)規(guī)模的可能［210］。相比于H型池，基于膜電極組的流動型電解池具有更高的通量，可實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，更加適用于工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用。另一方面，隨著可穿戴、柔性化等應(yīng)用需求的增多，迫切需要設(shè)計和開發(fā)種類繁多的新型酶促生物電催化反應(yīng)器以及合理的放大策略，以便更好地表征、建模、優(yōu)化和應(yīng)用于不同的系統(tǒng)［211］。決定酶促生物電催化系統(tǒng)能否進入實際應(yīng)用的另一關(guān)鍵因素是能量轉(zhuǎn)化中的效率和成本問題。除電極材料和酶的成本需進一步降低外，隨著合成生物學(xué)元件的開發(fā)和創(chuàng)新，采用更廉價、更穩(wěn)定的仿生輔酶或開發(fā)高效的生物電催化輔酶再生的方法有望有效降低成本，簡化產(chǎn)品分離過程，并延長系統(tǒng)運行時間。