郝騰騰， 袁菊花， 吳煜， 王靜， 徐曉華， 安佰平

1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100039；3.北京市豐臺(tái)婦幼保健院，北京 100069；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072

70%以上的癌癥患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的疼痛，是最常見和難以忍受的癥狀之一，但近50%的癌性疼痛即使應(yīng)用阿片類藥物也沒有得到充分的控制[1-2]。雖然世界衛(wèi)生組織的階梯止痛治療提供了緩解癌癥疼痛的有效方法，但同時(shí)對(duì)止痛藥的成癮性和藥物干預(yù)的不良反應(yīng)給疼痛的臨床管理帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[3]。由于癌痛發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，病因涉及原發(fā)腫瘤、治療以及社會(huì)心理等多維度，所以需要多學(xué)科的綜合方法來控制疼痛[4]。中藥可行氣活血、化瘀通絡(luò)、補(bǔ)虛止痛，內(nèi)服或外用具有明顯鎮(zhèn)痛效果，可以提高疼痛緩解率，且不良反應(yīng)少，無成癮性[5-7]。

《本草新編》載：“威靈仙，味苦，氣溫，可升可降，陰中陽也，無毒……散爪甲皮膚風(fēng)中癢痛，利腰膝脛踝濕滲冷疼，尤療折傷，治風(fēng)濕各病，皆宜用之，以其十二經(jīng)絡(luò)無處不到也……用之于補(bǔ)氣補(bǔ)血之中，自得祛痛祛寒之效?！蓖`仙為毛茛科植物威靈仙的干燥根及根莖，為祛風(fēng)濕藥，主要功效為“祛風(fēng)、通經(jīng)絡(luò)、止痛”，多用于“腰腳諸痛、手足麻痹”等[8]。威靈仙被明代醫(yī)家王肯堂稱為“止痛之要藥”，是傳統(tǒng)的一味鎮(zhèn)痛良藥，在痛癥中應(yīng)用廣泛，如風(fēng)濕痹痛、骨性痛、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛和內(nèi)臟痛等病證[9-11]。

臨床診療過程中運(yùn)用威靈仙治療癌性疼痛，具有一定的療效。亦有學(xué)者先后報(bào)道了運(yùn)用威靈仙復(fù)方治療癌性軀體痛及骨癌痛[12-13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)威靈仙可以消炎鎮(zhèn)痛并具有抗腫瘤作用[11，14]。但是，威靈仙治療癌性疼痛的研究報(bào)道較少，具體機(jī)制尚未清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選出威靈仙治療癌性疼痛的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，并通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)。為系統(tǒng)闡釋威靈仙治療癌性疼痛的作用機(jī)理及物質(zhì)成分基礎(chǔ)提供進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，并為后續(xù)藥物的基礎(chǔ)研究指明方向。

1 資料與方法

1.1 威靈仙化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)（TCMSP）檢索威靈仙藥物的活性成分及作用靶點(diǎn)[15]。根據(jù)成分的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行篩選，其中篩選條件設(shè)定為藥物口服生物利用度（ oral bioavailability，OB）≥30%，以及類藥性（ drug likeness，DL）≥0. 18，獲得威靈仙的有效成分（ingredients）[16]。并通過該數(shù)據(jù)庫并獲得相應(yīng)有效成分的作用靶點(diǎn)（related targets）。利用平臺(tái)Uniprot將基因ID 與基因Symbol 進(jìn)行轉(zhuǎn)換，以實(shí)現(xiàn)對(duì)有效成分所對(duì)應(yīng)的基因名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的目的。

1.2 癌性疼痛靶點(diǎn)

本研究中癌性疼痛靶點(diǎn)的獲取來源于Genecards 信息平臺(tái)[17]和OMIM 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。OMIM源于生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)，由NCBI 支持，是一個(gè)具有全面性、權(quán)威性和及時(shí)性的關(guān)于人類基因和遺傳疾病的知識(shí)庫，庫中記錄所有已知疾病的遺傳成分，并可鏈接至其他遺傳數(shù)據(jù)庫[18]。通過輸入關(guān)鍵詞“cancer pain”獲取與癌性疼痛相關(guān)靶基因，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果。運(yùn)用R 語言將威靈仙的活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和癌性疼痛的靶點(diǎn)匹配，并通過韋恩圖（venn diagram）得到威靈仙有效成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將威靈仙活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因和癌性疼痛相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行匹配，獲得交集基因即為威靈仙治療癌性疼痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。借助Cytoscape 軟件（Version3.7.2）構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。通過此網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)對(duì)威靈仙治療癌性疼痛作用機(jī)制的可視化，初步展現(xiàn)藥物-成分-疾病靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系。

1.4 關(guān)鍵靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用STRING 信息平臺(tái)預(yù)測(cè)蛋白-蛋白之間的相互作用關(guān)系。將威靈仙關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String 信息庫，獲得蛋白互作關(guān)系。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺被設(shè)置為反映Degree 值的大小，邊的粗細(xì)被設(shè)置為反映Combine score 大小。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因本體（gene ontology，GO）

分析和KEGG 通路分析借助Bioconductor 平臺(tái)（http://bioconductor.org/biocLite.R）和R 軟件對(duì)獲得的基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析[19]。首先在R 軟件中進(jìn)行安裝包的安裝，并執(zhí)行相關(guān)安裝包語言，通過R軟件運(yùn)行命令，導(dǎo)出GO富集分析表格，并繪制柱狀圖和氣泡圖。R軟件運(yùn)行命令后可導(dǎo)出KEGG 富集分析表格以及KEGG 通路圖，并繪制柱狀圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 威靈仙有效成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索的威靈仙化學(xué)成分57個(gè)，通過OB ≥30%，DL ≥0.18進(jìn)一步篩選，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及中藥特性[11，20-21]，共得到潛在活性成分28個(gè)，見表1。

表1 威靈仙中潛在活性成分Table 1 Potential active components of Radix Clematidis

（續(xù)表1）

2.2 威靈仙有效成分治療癌痛的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫與OMIM 數(shù)據(jù)庫，檢索“cancer pain”，合并去重后得到與癌性疼痛相關(guān)靶點(diǎn)基因共8886個(gè)。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選威靈仙的有效成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)以及無效的作用靶點(diǎn)后，得到威靈仙的有效成分作用靶點(diǎn)88 個(gè)。利用R 軟件將藥物有效成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射匹配，繪制韋恩圖（圖1）。共獲得交集靶點(diǎn)基因33 個(gè)，分別為PTGS1、NOS3、TYRP1、ADH1B、 PGR、 NR3C1、 NCOA2、 NCOA1、LCAT、 RHO、 CHRM1、 ADRA2C、 CHRM2、ADRA1A、 DAO、 CHRM3、 GABRA1、 CASP9、CASP3、 ICAM1、 NQO1、 CHRNA2、 BCL2、CASP8、 PRKCA、 PON1、 NR3C2、 AKR1B1、PLAU、ACHE、PPARG、GSK3B、GRIA2。

圖1 疾病靶點(diǎn)基因與藥物作用靶點(diǎn)基因的匹配Figure 1 Cancer pain target genes and Radix Clematidis target genes

2.3 藥物-潛在活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

威靈仙與癌性疼痛相關(guān)的潛在有效成分21個(gè)，分別為有香草酸、堿性果膠酶、2-乙?；量?、鄰乙?；鶎?duì)甲酚、WLN：Q1R、十四烷酸、戊二烯酸、亞油酸甲酯、丁香酚、異香草酸、BOX、齊墩果酸、甲苯醛、β-谷甾醇、豆甾醇、蒽貝素、2，3-二氫-4-羥基-2-吲哚-3-乙腈、烯丙基苯、香草醛、DBP、羥甲基糠醛。將威靈仙潛在活性成分及33 個(gè)關(guān)鍵靶基因?qū)隒ytoscape，構(gòu)建藥物-潛在活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。結(jié)果顯示，連接度前5 的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)镻TGS1、ADH1B、NCOA2、GABRA1、CHRM2。連接度前5的藥物有效成分為beta-sitosterol、Stigmasterol、HMF、DBP、BOX。

圖2 威靈仙有效成分與癌性疼痛的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Target network for active ingredients of Radix Clematidis in cancer pain

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用String信息平臺(tái)將威靈仙治療癌性疼痛可能的33 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)基因?qū)?，獲得所表達(dá)蛋白之間相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖3）。結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)間網(wǎng)絡(luò)圖包括33 個(gè)節(jié)點(diǎn)，預(yù)期86 條邊，實(shí)際257 條邊，這種富集結(jié)果表明作為一個(gè)基團(tuán)，這些蛋白質(zhì)至少在生物上是部分相連的?；诖私Y(jié)果進(jìn)一步運(yùn)用R 軟件繪制前30 位核心基因的可視化柱狀圖（圖4），得出CASP3 的鄰接節(jié)點(diǎn)為13 個(gè)靶蛋白基因，NOS3的鄰接節(jié)點(diǎn)為12個(gè)靶蛋白基因，PPARG 的鄰接節(jié)點(diǎn)為10 個(gè)靶蛋白基因，NR3C1 的鄰接節(jié)點(diǎn)為8 個(gè)靶蛋白基因，CHRM1 與PRKCA 的鄰接節(jié)點(diǎn)均為7 個(gè)。證明以上六個(gè)基因在整個(gè)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，可能在威靈仙的活性成分參與治療癌性疼痛過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖3 威靈仙治療癌性疼痛關(guān)鍵基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Protein interaction networks of Radix Clematidis in cancer pain

圖4 威靈仙治療癌性疼痛核心基因Figure 4 Core gene of Radix Clematidis in cancer pain

2.5 威靈仙中關(guān)鍵靶點(diǎn)基因生物功能分析

GO 注釋結(jié)果顯示，富集后排名靠前的生物學(xué)功能主要為神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性及乙酰膽堿受體活性。其余依次為半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡過程、類固醇激素受體活性、乙酰膽堿結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)的5-羥色胺受體活性、荷爾蒙結(jié)合等（圖5）。氣泡圖同理，圓點(diǎn)越大，富集越多，P值越小，表明該生物功能的富集顯著性越可靠，顏色越紅（圖5）。表明威靈仙可能通過調(diào)控多種生物學(xué)過程發(fā)揮治療癌性疼痛的作用。

圖5 威靈仙活性成分治療癌性疼痛關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 富集分析Figure 5 Enrichment analysis on GO biological processes of key targets from active compounds of Radix Clematidis

2.6 威靈仙關(guān)鍵靶點(diǎn)基因富集通路分析

通過注解及分析共得到44 條作用通路，結(jié)合P值分析，其中與癌性疼痛相關(guān)的有20 條。主要富集通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3KAkt信號(hào)通路、膽堿能突觸、鈣信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。同時(shí)還涉及麻疹、乙肝、甲型流感、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、弓形蟲病、p53 信號(hào)通路、鉑類耐藥、結(jié)直腸癌、前列腺癌等通路，表明威靈仙潛在活性成分靶點(diǎn)基因可以作用于不同的通路和癌種。P值與該差異表達(dá)基因在此條通路中富集的顯著性相關(guān)，P值越小越可靠，顏色越紅（圖6）。此處參照P值列出了與癌性疼痛相關(guān)度較可靠的3條關(guān)鍵通路，見表2。

表2 威靈仙治療癌性疼痛的關(guān)鍵通路Table 2Figure Key pathway of Radix Clematidis in cancer pain

圖6 威靈仙活性成分治療癌性疼痛關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集分析Figure 6 Enrichment analysis on KEGG pathways of key targets from active compounds of Radix Clematidis

3 討論

中藥復(fù)方及單體是現(xiàn)代中醫(yī)治療疾病的主要方法，通過潛在的多成分、多靶點(diǎn)相互作用起到治療效果，在復(fù)雜疾病的治療中發(fā)揮了重要作用。但中藥成分復(fù)雜，采用傳統(tǒng)研究方法分離活性成分然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證其作用靶點(diǎn)，工作量大，經(jīng)濟(jì)成本及人力物力投入較高，且目的不夠精準(zhǔn)。當(dāng)今網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了生物信息學(xué)知識(shí)，強(qiáng)調(diào)用網(wǎng)絡(luò)來呈現(xiàn)“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間的復(fù)雜關(guān)系[22]。網(wǎng)絡(luò)藥理及生物信息學(xué)的結(jié)合能夠系統(tǒng)、綜合分析中藥“多成分”的作用位點(diǎn)，展示疾病相關(guān)的靶標(biāo)和通路，通過網(wǎng)絡(luò)映射，揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子水平的作用機(jī)制，體現(xiàn)出中藥多成分、多靶點(diǎn)干預(yù)的特點(diǎn)，有效推動(dòng)了中藥復(fù)方及單體的研究。本研究運(yùn)用生物網(wǎng)絡(luò)信息分析，探索了威靈仙治療癌性疼痛的核心機(jī)理。

本研究直觀地呈現(xiàn)了21 個(gè)化合物成分、33 個(gè)靶蛋白、20 條作用通路和癌性疼痛疾病間的關(guān)聯(lián)。威靈仙作用于癌性疼痛靶基因的主要活性成分為β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、齊墩果酸（oleanolic acid）、HMF、DBP、BOX、EUG、鄰乙?；鶎?duì)甲酚（o-Acetyl-p-cresol）、肉豆蔻酸（myristic acid）等。β-谷甾醇屬于植物甾醇中重要組成，可以直接鎮(zhèn)痛，抗炎作用類似激素樣，但無激素類藥物副作用[23]，且對(duì)乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等具有抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖以及誘導(dǎo)凋亡的作用[24-25]，而腫瘤可以通過侵犯神經(jīng)、血管、骨骼及軟組織、釋放促炎癥和促痛覺過敏介質(zhì)等引起疼痛[26]。豆甾醇對(duì)急慢性疼痛均具有鎮(zhèn)痛作用[27]，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)凋亡[28-29]，且可以抗炎[30]，從而間接發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。威靈仙三萜皂苷主要由齊墩果酸衍生而來，根據(jù)所結(jié)合糖的數(shù)目及種類而異。齊墩果酸可以誘導(dǎo)caspase 活化，增加凋亡蛋白CASP3 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[31]，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以抑制肺癌、肝癌及結(jié)直腸癌等細(xì)胞株生長[32-34]。結(jié)合上述研究結(jié)果，說明本研究中篩選出的活性成分具有直接鎮(zhèn)痛及通過抑制腫瘤，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到間接鎮(zhèn)痛的作用。提示我們?cè)诤罄m(xù)中藥現(xiàn)代化制劑研發(fā)中，應(yīng)保證有效活性成分的最大程度保留。

威靈仙藥物活性成分作用靶點(diǎn)與33 個(gè)主要蛋白有很強(qiáng)的相互作用，其中CASP3，NOS3，PPARG，NR3C1，CHRM1 與 PRKCA 為關(guān)鍵靶蛋白，且與其他多個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。其中半胱天冬酶原3（CASP3）主要參與細(xì)胞的凋亡程序，無論外源性信號(hào)途徑和內(nèi)源性信號(hào)途徑，最終都必須激活CASP3 轉(zhuǎn)化為活化形式的半胱天冬酶3（CCASP3）才能執(zhí)行細(xì)胞最終凋亡程序，誘導(dǎo)凋亡是多種化療藥和靶向治療藥的共同通路[35-36]。NOS3為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS），在生理狀態(tài)下產(chǎn)生低濃度和中等濃度水平的NO，而NO 可以通過使p53 基因失活、促進(jìn)腫瘤血管生成、影響腫瘤細(xì)胞代謝等多重機(jī)制促進(jìn)腫瘤形成及發(fā)展[37-38]。PPARG基因是過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARy）的編碼基因，其在多種腫瘤組織中呈低表達(dá)，PPARy 被配體激活后可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管形成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故PPARG 可能是抑癌基因[39]。NR3C1 通過激活 PI3K/AKT/GSK3β 信號(hào)通路、促進(jìn)BCL-2 促凋亡蛋白表達(dá)[40]。蛋白激酶Cα（protein kinaseC-alpha，PRKCA）可誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[41]。CHRM1 屬于毒蕈堿型膽堿能受體中5個(gè)亞型之一，主要激活磷脂酶C（phospholipase C），通過ERK通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，從而在多種腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用，藥物抑制或敲除M1 受體可明顯減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[42-43]?？梢钥闯鐾`仙潛在活性成分治療癌性疼痛的關(guān)鍵作用包括上調(diào)CASP3、NR3C1 凋亡蛋白的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，上調(diào)PPARG 的表達(dá)并下調(diào)PRKCA、NOS3、CHRM1 的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖侵襲。

通過對(duì)威靈仙治療癌性疼痛的33 個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物進(jìn)程富集，顯示威靈仙可以通過中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)通路如神經(jīng)活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸、鈣信號(hào)通路，及炎癥相關(guān)通路如PI3KAkt 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路，激素調(diào)節(jié)相關(guān)通路如甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。KEGG分析提示，影響上述生物進(jìn)程的重要通路為膽堿能突觸信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路及細(xì)胞凋亡-多物種通路。由此，我們推測(cè)威靈仙治療癌性疼痛可能通過調(diào)控膽堿能信號(hào)通路及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流以及肌肉的收縮發(fā)揮直接止痛作用，且可以通過細(xì)胞凋亡-多物種通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，起到抑制腫瘤的作用，從而有可能間接控制了癌性疼痛。

綜上，本研究初步闡釋了威靈仙治療癌性疼痛的潛在活性成分及其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究提供了依據(jù)。本研究雖然采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)威靈仙主要藥效成分的治療癌性疼痛作用機(jī)制進(jìn)行了理論預(yù)測(cè)，但其進(jìn)一步的機(jī)制還需要通過生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。