鄧廣牒，曹庸，聶穩(wěn)，闞啟鑫，胡海娥，李學(xué)莉，賀麗蘋,3*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東廣州 510642）（2.東鵬飲料（集團）股份有限公司，廣東深圳 518055）（3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心，廣東廣州 510642）

檸檬是蕓香科柑橘屬類植物果實，根據(jù)外觀色澤可以分為黃色皮、青色皮兩大類。在我國檸檬產(chǎn)地有四川、臺灣、海南、兩廣以及福建等地區(qū)[1]，其中四川安岳氣候溫和，日照充足全年溫差不大，其檸檬果質(zhì)優(yōu)良，享有“檸檬之都”美譽。檸檬不僅香氣濃郁，而且含有豐富的維生素C、多酚、黃酮等物質(zhì)[2]，具有抗氧化[2]、抑菌消炎[3]、抗腫瘤[4]等功效，在食品飲料、香精香料行業(yè)應(yīng)用廣泛。

檸檬的香氣是反映檸檬品質(zhì)的重要指標。目前，電子鼻[5]、GC-MS/O[6]等技術(shù)已經(jīng)成為常用的香氣分析手段[7,8]。何塞[6]利用GC-MS 對4 種檸檬揮發(fā)性成分進行比較，并鑒定出75 種揮發(fā)性成分，確定檸檬烯、月桂烯、萜品烯等為主要揮發(fā)性成分。張海鵬[9]利用GC-MS 對106 種柑橘進行揮發(fā)性成分分析并確定柑橘汁中162 種化合物，其中檸檬烯、檸檬醛以及蒎烯含量最高。馮仕[10]通過GC-MS/O 聯(lián)用對荔枝揮發(fā)性化合物進行表征并鑒定出香葉醇、芳樟醇、呋喃醇為荔枝的關(guān)鍵香氣成分。朱春華[11]利用GC-MS 分析不同品種檸檬精油揮發(fā)性成分進行比較，尤力克檸檬中檸檬烯、蒎烯、檸檬醛等特征香氣成分高于其他品種。

上述風(fēng)味研究均是儀器差異性分析，近年來綜合因子得分被用于綜合品質(zhì)評價方面。綜合因子得分是利用統(tǒng)計學(xué)分析方法將指標數(shù)據(jù)，通過計算降維后的特征值矩陣，進行主成分分析，確定其個數(shù)和表達量，最后計算樣品在不同主成分上的得分，達到綜合評價的效果，如傅隆生[12]利用主成分得分與聚類分析，分析不同種類獼猴桃的綜合品質(zhì)評價，結(jié)果顯示，兩種模式具有高度一致性。主成分綜合得分分析最先應(yīng)用在選優(yōu)育種方向[12-14]，也逐漸應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、食品品質(zhì)評價和質(zhì)量控制方面，如石彥國等[15]通過分析45 種不同大豆的理化指標和表觀特性，通過主成分綜合得分結(jié)合感官評價篩選出5 種適合蒸煮加工的大豆；李麗梅通過接種不同酵母于雪花梨中，以總酸、多酚、pH等理化指標，利用因子得分計算得出釀酒酵母LA-BA所釀梨酒的綜合品質(zhì)最好[16]；張穎穎等[17]通過主成分綜合評價對黑、白芝麻醬進行品質(zhì)判別，結(jié)果顯示白芝麻綜合得分高于黑芝麻，與感官評價結(jié)果一致，綜上主成分得分評價是一種客觀的綜合評價方法。由于檸檬品種豐富，不同檸檬風(fēng)味成分、品質(zhì)質(zhì)量差異較大，全方位多手段研究檸檬揮發(fā)性風(fēng)味差異，對檸檬的綜合利用具有重要意義，目前對于檸檬的風(fēng)味研究僅使用單一技術(shù)手段[18,19]，對檸檬關(guān)鍵香氣成分多種技術(shù)聯(lián)合分析以及多元統(tǒng)計綜合評價體系缺乏報道。

本文以安黃檸檬（AH）、安青檸檬（AQ）、香水檸檬（XS）以及海南青檸檬（HQ）為原料，通過頂空固相微萃取- 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用/ 嗅聞儀（HS-SPME-GC-MS/O）結(jié)合電子鼻對四種檸檬揮發(fā)性風(fēng)味進行分析。結(jié)合ROAV 值確定檸檬中關(guān)鍵風(fēng)味組分，通過測定不同品種檸檬理化特性，并對果肉中的多酚黃酮進行定性與定量，進一步計算主成分綜合得分，建立不同品種檸檬原材料綜合評價體系，以此對不同品種檸檬進行綜合的風(fēng)味差異判定。

1 材料與方法

1.1 原料

檸檬樣品由東鵬特飲有限公司提供，分別采自四川省資陽市安岳縣的安岳青檸檬（AQ）和安岳黃檸檬（AH）、海南省?？谑行阌^(qū)的海南青檸檬（HQ）、廣東省肇慶市播植鎮(zhèn)的香水檸檬（XS）四種品種。正構(gòu)烷烴C7-C20混合標準品，美國O2SI 公司；環(huán)己酮（色譜級）、甲醇（色譜級）、丁香酸、圣草次苷、橙皮苷（色譜級）均為麥克林公司；氯化鈉、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚、福林酚、碳酸鈉等分析純試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

6890-5973 N 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；LC-15C 液相色譜儀、SPD-M20A 紫外/可見檢測器、SIL-10AF 自動取樣器（配備Diamonsil 5μm C18(2)，25×4.6 mm），日本島津公司；10 種金屬氧化物半導(dǎo)體感應(yīng)器的PEN3 系統(tǒng)（Airsense Analytics GmbH，Schwerin，Germany）電子鼻，德國Airsense 公司；CAR/PDMS 固相微萃取纖維頭（75 μm），美國sigama 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 檸檬理化特性指標的測定

新鮮檸檬自采摘后立即榨汁，裝入聚乙烯真空包裝袋放置-80 ℃。分別對不同品種檸檬的指標測定。pH測定：參照GB/T 10468-1989 方法測定。總酸測定：參照GB/ 12456-2021 食品安全國家標準 食品中總酸的測定。固形物含量測定：參照GB/T 12143-2008 飲料通用分析方法中可溶性固形物的測定。維生素C 的測定：參考GB/ 5009.86-2016 第三法；2,6-二氯靛酚滴定法進行測定。

多酚的測定：分別將不同品種的檸檬的果皮和果肉分開，果肉榨汁冷凍干燥粉碎過篩（200 目），稱取0.25 g 凍干粉末加入25 mL 體積分數(shù)80%甲醇，超聲提取30 min，在5 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液備用。采用上述的同樣操作對沉淀進行二次提取兩次，合并兩次上清液定容至50 mL。采用福林酚法測定總酚，結(jié)合高效液相法測定多酚種類和含量。將樣品各種多酚的保留時間和標準品的保留時間進行對比并進行定性，外標法（R2≥0.99）對不同檸檬品種中各種酚與黃酮含量進行定量。

1.3.2 檸檬揮發(fā)性風(fēng)味成分測定

1.3.2.1 電子鼻對不同品種檸檬汁風(fēng)味分析

參考Chen 等[20]的方法并略作修改，準確稱取6.0 g的不同品種檸檬果汁，置于25 mL 頂空瓶中，室溫下平衡30 min。將Luer-Lock 針插入樣品頂空瓶中，過濾的空氣以120 mL/min 的恒定速率泵入傳感器陣列，測量持續(xù)300 s。10 個傳感器的響應(yīng)值描述如下。

1.3.2.2 HS-SPME-GC-MS/O 對檸檬揮發(fā)性香氣成分提取與分析

（1）HS-SPME 香氣成分提取

參考Gao 等[21]的方法略作修改，稱取6 g 果汁于25 mL 螺口頂空樣品瓶中，加入4 g 氯化鈉和1 μL 內(nèi)標環(huán)己酮，用聚四氟乙烯隔墊密封，在45 ℃磁力攪拌器上加熱平衡5 min 后，用75 μm CAR/PDMS 萃取頭萃取45 min 后，解吸5 min。

（2）GC 條件

色譜柱：DB-WAX 毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：260 ℃；載氣（N2）流量：1 mL/min；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持2 min，以4℃/min 速率升至210 ℃，保持10 min。

（3）MS 條件

四極桿溫度150 ℃，電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z：35～500。根據(jù)總離子流圖和出峰時間、譜庫（NIST 08 譜庫）、保留指數(shù)進行定性，添加環(huán)己酮內(nèi)標進行定量。

（4）嗅聞儀條件

MS 四極桿溫度150 ℃，電子轟擊離子源，傳輸線溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍同MS 條件。嗅聞口與MS 端的分流比例為1:1，嗅聞口溫度260 ℃，GC-MS/O 分析由5 名成員分別對樣品進行嗅聞描述，記錄氣味特征及保留時間。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.3.1 GC-MS 定性與定量

以C7-C20飽和烷烴作為標準，用相同的升溫程序?qū)φ龢?gòu)烷烴進行分離與測定，計算所測試樣品中各組分的保留時間指數(shù)（Kovats Retention Indices，RI），通過數(shù)據(jù)庫檢索及參考文獻中相關(guān)物質(zhì)的保留時間指數(shù)共同定性。以1 μL 環(huán)己酮為內(nèi)標進行相對定量。

1.3.3.2 相對氣味活度值（ROAV）計算

參考劉登勇[22]的計算方法，采用相對氣味活度值（ROAV）評價各揮發(fā)性組分對檸檬樣品風(fēng)味的貢獻，相對氣味活度值的計算公式為：

式中：

CA——各風(fēng)味組分相對百分含量；

TA——各風(fēng)味組分感覺閾值；

Cstan——對樣品風(fēng)味貢獻最大的風(fēng)味組分的相對百分含量；

Tstan——對樣品風(fēng)味貢獻最大的風(fēng)味組分的感覺閾值。

ROAV＞1，表明該組分對樣品的風(fēng)味貢獻最大，即為關(guān)鍵特征風(fēng)味組分；0.1≤ROAV＜1，表明該組分會對樣品風(fēng)味起修飾作用；ROAV＜0.1，說明該組分對樣品風(fēng)味影響不顯著，在一定范圍內(nèi)，ROAV越大說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味貢獻越大[23]。

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進行處理，采用t檢驗進行樣品間顯著性差異分析，SIMCA-P 14.1 進行主成分分析（PCA），Origin 2019 軟件作圖，實驗結(jié)果以平均值±誤差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種檸檬的理化指標分析

檸檬在生長成熟過程中，果汁品質(zhì)質(zhì)量和香氣含量亦會受到維生素C，總酸等理化指標的影響，不同品種檸檬汁的理化指標測定結(jié)果如表2所示，可以看出：4 個不同品種檸檬間的理化指標都存在顯著差異（p＜0.05）。pH 值、總酸是影響檸檬加工品質(zhì)的重要因素，總酸含量越高，果汁的儲藏性越好，AQ 的總酸含量最高（4.59%），HQ 的總蒜最低（3.93%）?？偹?、固酸比是評價檸檬口感與品質(zhì)的重要指標，AH 的固酸比最高（1.79），AQ 的維生素C 含量最高（34.97 mg/100 g），其次是AH（31.48 mg/100 g）、XS（23.09 mg/100 g），最低的是HQ（30.17 mg/100 g），與洪林[24]研究尤力克檸檬在成熟期維生素C 含量結(jié)果一致。

表1 PEN3 電子鼻傳感器及其性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensor

表2 不同品種檸檬的理化指標結(jié)果分析Table 2 Analysis of physical and chemical indexes of different varieties of lemon

多酚可以抑制促炎因子的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)，食用富含多酚的食物，可以減少心血管疾病的發(fā)生[25]。從表2可知，AH 多酚含量最高，HQ 最低。四川地區(qū)的AQ、AH 檸檬多酚含量顯著性高于廣東、海南兩地檸檬（p＜0.05），與高煒研究結(jié)果一致[1]，原因可能是氣候、土壤等條件會影響檸檬果肉多酚的積累。

利用高效液相色譜法對檸檬中主要多酚、黃酮化合物進行測定分析，結(jié)果也列于表2中。從結(jié)果可以看出：四種檸檬中丁香酸、圣草次苷以及橙皮苷的含量存在顯著性差異（p＜0.05），其中丁香酸在XS 中的含量最高，在HQ 中含量最低；而圣草次苷在AH 中的含量最高，在HQ 中最低，分別為4 081.32、3 027.06、638.61、267.66 mg/kg。AH 含有橙皮苷最多，其次是HQ、AQ，最后是XS 檸檬，分別為1 010.25、573.74、568.91、223.35 mg/kg，與董昕穎[26]的研究結(jié)果一致。

2.2 不同品種檸檬的電子鼻分析

電子鼻是一種測定揮發(fā)性化合物風(fēng)味敏感度的分析技術(shù)，樣品中風(fēng)味輕微的變化便會引起傳感器響應(yīng)值的差異[27]。4 種檸檬的風(fēng)味雷達圖結(jié)果如圖1所示，電子鼻2、7、9 號感應(yīng)器具有明顯的響應(yīng)，表明檸檬中氮氧化合物、芳香化合物對風(fēng)味的貢獻率較大，其中AH 在2 號感應(yīng)器響應(yīng)最高，說明氮氧化合物在AH中貢獻較高，XS、AH、AQ 在9 號感應(yīng)器中的響應(yīng)值（20 左右）與HQ 的響應(yīng)值（10 左右）差異較大，說明XS、AH、AQ 中有機硫、芳香化合物差異較大。

圖1 不同品種檸檬風(fēng)味輪廓圖Fig.1 Flavor profile of different lemon varieties

主成分分析如圖2所示，在PCA 空間分布圖中顯示了不同品種檸檬樣品的揮發(fā)性成分。兩個主成分貢獻率分別為（61.74%和25.81%）總貢獻接近87.55%，表明這兩個主成分構(gòu)成了4 種不同檸檬樣品的主要特征信息。4 種不同檸檬數(shù)據(jù)點組間具有較好聚集性以及樣品間具有一定分散性，即PCA 主成分分析可以有效區(qū)分不同檸檬風(fēng)味。PC1 軸所示樣品由XS＜AQ＜HQ＜AH 等排列降低，而在PC2 軸上樣品HQ＜AQ＜XS＜AH 排列降低。其中XS 和AQ（主要分布在PC2 負半軸上）兩樣品在PCA 空間區(qū)域分布較為接近，即AQ和XS 檸檬風(fēng)味成分具有一定的相似度。而HQ（主要分布在PC1 負半軸和PC2 正半軸上）和AH（主要分布在PC1 和PC2 正半軸上）兩種檸檬在空間區(qū)域距離較遠，亦與XS 和AQ 空間區(qū)域距離較遠，即與XS、AQ 品種的揮發(fā)性成分相似度較低。

圖2 不同品種檸檬揮發(fā)性物質(zhì)的的PCA 圖Fig.2 PCA of volatile compounds of different lemon varieties

2.3 不同品種檸檬GC-MS/O 數(shù)據(jù)分析

采用HS-SPME-GC-MS 分析了不同品種檸檬樣品中的揮發(fā)性組分，圖3為不同樣品揮發(fā)性組分總離子色譜圖（TIC），GC-MS 測定不同檸檬揮發(fā)性成分具體含量結(jié)果如表3所示。從中可以看出，4 種檸檬揮發(fā)性組分種類以及含量各不相同，總檢出63 種揮發(fā)性組分，將其分為6 大類，即烯類44 種、醇類有5 種、醛類6種、酯類5 種、酮類2 種、酚類1 種。AH 中烯類組分占總揮發(fā)性成分的85.28%、AQ 中烯類占總揮發(fā)性成分的88.99%、XS 中烯類占總揮發(fā)性成分的74.53%、HQ 中烯類占總揮發(fā)性成分的98.25%。醛類在XS 中含量占總揮發(fā)性成分的（22.25%），在AH 中有4.79%。酯類在AH 中占總揮發(fā)性成分的含量為8.72%，而其他3 個品種中酯類含量均不高。酚類只在AQ 中有檢出。4 種檸檬揮發(fā)性成分的差異較大，可能是由于各地區(qū)的氣候、土壤、成熟程度的不同，導(dǎo)致結(jié)果差異。而AQ和AH 的差異集中在單萜烯含量的不同，可能是幼果不同處理導(dǎo)致含量的差異，以及單萜烯類在成熟過程中生成含氧萜烯類。

圖3 不同品種檸檬GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion flow of different lemon varieties

表3 不同品種檸檬果汁揮發(fā)性成分GC-MS 結(jié)果分析Table 3 GC-MS analysis of volatile components of lemon juice of different varieties

續(xù)表3

通過GC-MS 測定4種不同品種檸檬揮發(fā)性組分中有13 種共有峰：主要有α松油烯、月桂烯、δ-杜松烯、β-紅沒藥烯、松油烯、檸檬烯、合金歡烯、芳樟醇以及乙酸橙花酯等組分，將其分為烯類11 種、醇類1 種、酯類1 種。D-檸檬烯含量最高，尤其在AH 中最高，其次是AQ、XS，最后是HQ。檸檬烯是柑橘類水果中普遍存在的一種組分，不僅具有檸檬的清香氣味、水果味[28]。而且具有抗菌和防腐等效果，被廣泛用于治療胃痛、乳腺癌等[29]。α蒎烯具有木香、樹脂香[30]，有很好的抗菌活性[31]以及消炎鎮(zhèn)痛等作用[32]。月桂烯具有草香、松樹香[10]香蠟和香精氣味以及天竺葵等香氣[33]。α-萜品烯、萜品油烯具有松林香氣[34]。芳樟醇具有抗菌、抗炎活性[35]、抗癌[36]等功能活性作用，并且具有濃郁的柑橘氣味[36]紫丁香、鈴蘭與玫瑰花香、木香、果香等香氣[10,37,38]。乙酸橙花酯呈現(xiàn)出玫瑰香氣、花果香[33]，乙酸香葉酯具有玫瑰花般香[39]。

利用SIMCA-P 軟件對不同品種檸檬揮發(fā)性成分進行主成分分析，結(jié)果如圖4所示。PCA 兩個主成分合計貢獻率為69.47%，可以說明了原始數(shù)據(jù)69.47%的信息。二維空間分布可以觀察到不同樣品差異明顯，AH、AQ、HQ 主要體現(xiàn)在PC2 上，而XS 與AH 主要體現(xiàn)在PC1，以及組內(nèi)樣本點相互靠攏說明重復(fù)性較好。即表明GC-MS 結(jié)合主成分分析能有效區(qū)分不同品種檸檬，為GC-MS 用于不同地區(qū)原料的溯源鑒別提供參考方法。

圖4 檸檬揮發(fā)性成分的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of lemon volatile components

ROAV值是一種可以量化樣品中揮發(fā)性風(fēng)味組分對整體香氣貢獻值的指標，從表4可以看出：ROAV＞1的風(fēng)味化合物有8 種，分別為檸檬烯、羅勒烯、合金歡烯、芳樟醇、桉葉油醇、辛醛、壬醛、檸檬醛以及癸醛，是檸檬中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，具有明顯的柑橘、檸檬果香等香氣，是呈現(xiàn)檸檬香氣的主要化合物。而0.1＜ROAV＜1 的有5 種，是檸檬中的修飾性風(fēng)味化合物。其中AH 檸檬中檸檬烯和壬醛的貢獻值高于其他品種，表現(xiàn)出濃郁的檸檬香氣。AQ 中檸檬烯、壬醛以及葵醛的貢獻值均小于AH，但是桉葉油醇卻遠遠高于AH，呈現(xiàn)草藥香氣。而羅勒烯和辛醛是XS 檸檬中所獨有，且ROAV值＞1 的辛醛、檸檬醛、癸醛貢獻值均高于其他樣品，即呈現(xiàn)出柑橘類青草香香氣，也是香水檸檬香氣濃郁的主要原因之一。ROAV值可以客觀分析揮發(fā)性組分對整體風(fēng)味的貢獻，但是無法對樣本間的整體香氣進行評價。

表4 不同品種檸檬相對氣味活度值的結(jié)果分析Table 4 Results of the relative odour activity values of lemon juice of different varieties

續(xù)表4

如表5所示，3 個主成分累計方差貢獻值達到100%，說明3 個主成分能代表17種品質(zhì)指標的全部信息，如表6所示，主成分PC1 方差貢獻值為48.61%，特征值為8.26，即以固形物、橙皮苷、檸檬烯、壬醛以及芳樟醇為主要影響指標。而PC2 主要以pH 值、羅勒烯以及檸檬醛為主。桉葉油醇則是PC3 的主要影響指標。根據(jù)貢獻率所示，檸檬營養(yǎng)品質(zhì)指標主要是可溶性固形物、橙皮苷、pH，揮發(fā)性風(fēng)味成分主要是檸檬烯、壬醛、芳樟醇、羅勒烯以及檸檬醛等指標。

表5 檸檬品質(zhì)主成分的方差貢獻率Table 5 Variance contribution rate of principal components of lemon quality

表6 檸檬品質(zhì)指標主成分載荷矩陣Table 6 Principal component load matrix of lemon quality index

以4 種檸檬樣本的總酸、pH 值、固酸比、固形物以及多酚、維生素C 和8 種檸檬關(guān)鍵風(fēng)味組分為綜合評價指標，進行主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率并計算綜合得分對檸檬綜合品質(zhì)進行分析。

根據(jù)綜合PCA 主成分因子得分計算，算出4 種檸檬主成分得分以及綜合得分，如表7所示。根據(jù)PC1中的FAC1 得分所示，AH 得分最高（1.32）其次是AQ（0.12），即表明AH 品種中固形物、固酸比、橙皮苷、檸檬烯、壬醛以及芳樟醇優(yōu)于XS 和HQ，因為AH 與AQ 是同一產(chǎn)地不同樣本，故在主成分1 中存在很大的相似性。且綜合得分最高，說明各指標較為協(xié)調(diào)、香氣怡人以及功能作用更優(yōu)于其他品種，即表明安岳檸檬更適合于綜合利用，而FAC2得分顯示XS 品種最高，說明羅勒烯以及檸檬醛、合金歡烯等具有清香檸檬香氣的組分含量高于其他品種，即驗證了“香水檸檬”香氣濃郁的稱號，XS 主要是以香氣為主，多用于直接食用或菜肴增香等應(yīng)用。

表7 不同品種檸檬的主成分因子得分Table 7 Principal component factor scores of four varieties of lemon

3 結(jié)論

AH 檸檬中固酸比、總酚等含量均優(yōu)于其他品種檸檬，AQ 中維生素C 含量最高。GC-MS 數(shù)據(jù)顯示檸檬揮發(fā)性組分有63 種，主要為烯類、醛類、醇類、酯類、酮類和酚類，電子鼻結(jié)果表明，氮氧化合物、硫化物、有機硫化物對檸檬風(fēng)味貢獻較大。通過相對氣味活度值分析，ROAV＞1 的關(guān)鍵風(fēng)味化合物有8 種，其中芳樟醇、壬醛、檸檬烯、檸檬醛以及癸醛貢獻值較高，結(jié)合嗅聞結(jié)果顯示他們是檸檬濃郁和特征香氣的重要組分。

利用不同品種檸檬理化特性、關(guān)鍵香氣成分進行綜合得分評價，結(jié)果顯示：AH 綜合得分最高、其次是XS 檸檬，AH 檸檬主要體現(xiàn)在固酸比、橙皮苷以及香氣組分得分較高，說明AH 更加適合綜合利用，而XS檸檬在FAC2 香氣成分得分較高，說明XS 檸檬更適合于直接食用或菜肴增香等應(yīng)用。